一种猪α干扰素及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种猪α干扰素及其应用，依据大肠杆菌原核表达系统密码子的偏嗜性，选择高表达密码子设计合成一种猪α干扰素，其氨基酸序列序列如SEQ ID NO.1所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术制备猪α干扰素的方法简单，成本低，易于工业化生产，猪α干扰素表达量高，包涵体处理过程中变性彻底，复性蛋白得率高，本发明专利技术制得的猪α干扰素效价高，能够抑制100TCID

Swine interferon alpha and its application

The invention provides a porcine alpha interferon and its application, based on the preference of the prokaryotic expression system of Escherichia coli codon, high expression of codon design and synthesis of porcine interferon alpha, the amino acid sequence of sequences such as SEQ ID NO.1 shows, the nucleotide sequence encoding is shown as SEQ ID NO.2. The method for preparation of porcine interferon alpha is simple, low cost, easy industrial production, high levels of expression of porcine interferon alpha, inclusion body in the process of degeneration thoroughly, high rate of protein refolding, porcine interferon alpha was prepared by the invention is high, can inhibit 100TCID

【技术实现步骤摘要】
一种猪α干扰素及其应用
本专利技术涉及蛋白质工程领域，具体地，涉及一种猪α干扰素及其应用。
技术介绍
近年来猪病毒性传染病日益泛滥，已严重地威胁着我国畜牧业的持续发展。免疫抑制病及病毒抗原快迅变异，常导致疫苗免疫失败；加之不断出现新的病毒病，目前还尚无成功的疫苗接种预防。另一方面，疫苗对疾病只有预防作用，治疗还有赖于抗生素的使用。而一些抗药性菌株的出现，给人类食品和健康带来极大的威胁，一些国家已明令禁止在养殖生产中应用某些抗生素和抗菌剂。因此，生产中迫切需要一种既有效又有利于环保的新方法来防控畜禽疾病。实践证明，干扰素作为一种广谱的抗病毒剂，在病毒性传染病的防控方面具有广阔的应用前景。传统的生产方法：由中草药等诱生剂诱导产生干扰素，因纯化工艺复杂，产量少、作用缓和等诸多因素影响而极大限制了在临床和科研的应用。随着猪干扰素基因的克隆成功，对其重组产物的临床应用及作用机理的研究也随之展开。1990年，Lefevre和LaBonnar等人在大肠杆菌中表达了PoIFN-αl基因，得到了一个含189个氨基酸的前体蛋白，去除其N端的含23个氨基酸的信号肽后，得到了具有完全天然PoIFN-αl生物学活性的产物，并且其在猪源性细胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激猪白细胞产生的干扰素的6倍。PolJM等(1991)研究发现：rPoIFN-α1能够抑制伪狂犬病毒(PRV)强毒和中等毒力病毒在猪鼻腔黏膜组织stroma细胞层的增殖，PRV接种干扰素处理的猪成纤维细胞和猪肾细胞，病毒滴度明显下降。HorisbergerMA(1992)比较了重组PoIFN-α(rPoIFN-α)和重组PoIFN-γ(rPoIFN-γ)在猪的细胞中抗病毒活性的区别，发现rPoIFN-α可大大降低猪水泡性口炎病毒(VSV)在猪PK-15上引起的病变，并能削弱猪水泡性口炎病毒(VSV)和流感病毒在猪肾细胞中的复制。JordanLT等(1994)发现rPoIFN-α对传染性胃肠炎病毒(TGEV)有很好的预防作用。BuddaertW(1998)对rPoIFN-α在体内、外对猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的抗病毒活性进行了研究，发现PRRSV在体内、外对rPoIFN-α都很敏感，rPoIFN-α可明显抑制PRRSV的产量和感染细胞的数量。chinsangaramJ.等(2001)人用大肠杆菌表达rPoIFN-α或rPolFN-α并分别进行了抗口蹄疫病毒(FMDV)实验，发现rPoIFN-α和rPoIFN-α抑制FMDV复制是在蛋白质翻译水平上的，主要是激活双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)作用的结果：在细胞中加入PKR抑制剂2-氨基嘌呤后，病毒的产量就会上升；而RNaseL和PKR基因缺失的细胞在干扰素的作用下仍能感染FMDV，这充分说明了PKR在抑制病毒复制中起作用。我国学者也对猪α干扰素进行了多项研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一种新的猪IFN-α基因并在大肠杆菌中进行了其成熟蛋白的单纯表达，表达产物具有较高的抗病毒活性。杜以军等利用猪IFN-α的成熟蛋白基因构建了重组腺病毒质粒pAd-PoIFN-α转染HEK-293A细胞，滴度为107TCID50/mL。RT-PCR证明目的基因在mRNA水平上可有效表达；在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性，从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。谢海燕等(2004)克隆了猪IFN-α基因，构建了原核表达载体，初步对其进行了原核表达研究；我国学者夏春等(2005)报道了用pQE30表达载体在大肠杆菌原核表达的rPoIFN-α在猪源细胞和非猪源细胞系上可显著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖，证明了原核表达PoIFN-α的可行性及将基因工程原核表达的PoIFN-α真正用于生产实践中作为抗病毒制剂可行性。曹瑞兵等对猪IFN-α1基因进行了改造，在保留编码蛋白序列的同时，使用了大肠埃希菌的偏爱密码子，将合成的猪IFN-α1成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体pRLC中，实现了猪IFN-α1在大肠埃希菌中的高效表达，且重组猪IFN-α1具有较高的抗病毒活性，约为6.4×106U/mg。在猪α干扰素基因研究方面，2000年夏春等首次对猪干扰素α基因进行分子克隆与测序，克隆片段长668个核苷酸，编码186个氨基酸。其中，76～636位含有1个ORF，蛋白分子量为21.8Ku。除此之外，温纳相(2005)和彭贵青(2005)也对猪干扰素α的基因进行了分子克隆与测序，并检测其生物活性。在表达方面，曹瑞兵(2004)和吴阳(2006)分别对猪α干扰素的基因进行了原核表达，表达量分别为17.3％和18％，表达产物均为融合蛋白。其中曹瑞兵用重组猪α干扰素处理猪肾传代细胞PK-15后，细胞病变抑制法(CPE50)测定结果表明，重组猪α干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV)的感染。但以上技术均具有原基因密码子的表达量低、抗病毒活性低的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的一种抗病毒活性高的猪α干扰素。本专利技术的猪α干扰素含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本专利技术依据大肠杆菌密码子偏好性，经过密码子改造，获得了编码猪α干扰素的基因，含有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。含有上述基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞均属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供一种含有所述猪α干扰素的药物。具体地，该药物为抗病毒、抗肿瘤或增强免疫功能的药物。本专利技术提供了氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的猪α干扰素在制备猪保健品或药物中的应用。进一步地，本专利技术提供一种制备所述猪α干扰素的方法，包括以下步骤：(1)合成SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，将目的基因克隆入pUC57，转化至大肠杆菌，取转化后的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定；(2)鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体相连接，转化至大肠杆菌，涂布于含氨苄霉素的LB培养基平板进行过夜培养，取前述平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆质粒双酶切，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功；(3)构建完成的重组表达菌于含氨苄霉素的LB培养基中进行扩增，放大培养，至细菌达到对数生长期，测细菌在600nmOD值在0.6～0.8时，加入IPTG，过夜诱导表达，收集细菌，鉴定重组蛋白；(4)用超声破碎菌体后，得到包涵体，经过包涵体洗涤，变性，复性，再经亲和层析纯化蛋白。其中，步骤(4)中超声破碎菌体后，得到包涵体的方法为：收集细菌，3000-8000rpm/min离心20-40min，弃上清，留沉淀，加入10-20倍体积超声缓冲液重悬菌体，超声裂解得到包涵体；所述超声缓冲液的配方为：50mMTris，50mMNacl，0.5mMEDTA，pH8.0；所述超声裂解条件为：功率：350-400W，工作3秒，间隔5秒，超声5-10min，重复3-4次。其中，步骤(4)中变性是使用变性液处理包涵体，使蛋白变性后溶解于变性液中；所述变性液配方为50mMTris-Hcl，8MUrea，20mMDTT，pH10-12。优选地，变性液的pH为10-10.5。现有技术中，常采用的变性液pH为8.3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪α干扰素，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2016.01.22 CN 20161004548401.一种猪α干扰素，其特征在于，含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述猪α干扰素的基因，其特征在于，含有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述基因的表达载体。4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。5.含有权利要求1所述猪α干扰素的药物。6.如权利要求5所述的药物，其特征在于，其为抗病毒、抗肿瘤或增强免疫功能的药物。7.权利要求1所述的猪α干扰素在制备猪保健品中的应用。8.一种制备权利要求1所述猪α干扰素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，将目的基因克隆入pUC57，转化至大肠杆菌，取转化后的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定；(2)鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体相连接，转化至大肠杆菌，涂布于含氨苄霉素的LB培养基平板进行过夜培养，取前述平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖明，孙俭波，焦培荣，古明珠，白大勇，孙超，廖想，吴斯宇，崔进，冯赛祥，徐成刚，
申请(专利权)人：华南农业大学，北京利昂盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44