犬重组干扰素-α6及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种犬重组干扰素‑α6及其制备方法与应用。该犬重组干扰素‑α6的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还提供了犬重组干扰素‑α6的制备方法，利用毕赤酵母菌株表达系统表达含有本发明专利技术密码子优化了的犬重组干扰素‑α6基因的重组酵母工程菌，获得分泌表达的高活性犬重组干扰素‑α6，本发明专利技术方法制备得到的犬重组干扰素‑α6纯度高，纯化后达到1.49mg/ml，1L重组酵母工程菌的蛋白产量达到98mg。抗病毒比活性为3.6×107IU/mg，能够有效预防和治疗犬瘟热、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎等传染性疾病，具有较高的安全性，应用前景良好。

Canine recombinant interferon alpha 6 and its preparation and Application

The invention provides a canine recombinant interferon alpha 6 and a preparation method and application thereof. The nucleotide sequence of the recombinant interferon alpha 6 is shown in SEQ ID NO.1. The invention also provides a preparation method of canine recombinant interferon alpha 6, expresses the recombinant yeast engineering strain containing the canine recombinant interferon alpha 6 gene optimized by the Pichia pastoris expression system, obtains the highly active canine recombinant interferon alpha 6 secreted and expressed, and obtains the canine recombinant interferon alpha 6 prepared by the method of the invention. The purity of interferon_alpha 6 was high, and the purified protein reached 1.49 mg/ml. The protein yield of recombinant yeast strain 1L reached 98 mg. The specific antiviral activity is 3.6 *107IU/mg, which can effectively prevent and treat canine distemper, canine parvovirus, canine parainfluenza virus, canine infectious hepatitis and other infectious diseases. It has high safety and good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
犬重组干扰素-α6及其制备方法与应用
本专利技术属于生物制品领域，公开了一种高活性的犬重组干扰素-α6，同时还提供了高效表达犬重组干扰素-α6的制备方法与应用。
技术介绍
近年来，我国的宠物业迅速发展,宠物犬、猫的数量日益增多，宠物源病毒性疫病是目前危害比较严重的疾病。最常见的犬瘟热、犬细小病毒病等通常危害严重，发病率高，传染性强，死亡率高，是危害我国养犬业最为严重的传染病，严重制约了宠物业的发展。传统的治疗方案在临床上很难奏效，因此进行积极治疗和预防犬的病毒病是业内最为关注的问题。干扰素(Interferon,IFN)是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮系统(人体免疫系统的一种)、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白，是一种具有多种功能的活性蛋白质，具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。干扰素可分为三种类型I型、II型、III型，其中I型干扰素包括有IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十余个亚型，各型结构类似，仅存在少量氨基酸的差异。IFN-β仅有一个亚型。采用基因工程技术制备犬干扰素是获得经济、有效干扰素的重要途径。目前由于原核表达的重组IFN-α一般不能进行翻译后修饰，与天然干扰素-α的空间构想有一定差距，其免疫原性较低，而真核表达系统能够进行转录和翻译后修饰，故其结构更接近于天然干扰素-α。毕赤酵母是一种新型的外源基因表达系统，已有多种蛋白在此系统中高效表达，不存在原核表达系统的内毒素难以去除的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题，并可进行类似高等真核生物的信号肽剪切和糖基化等翻译后加工。表达载体pPICZαP的醇氧化酶启动子AOX1可用甲醇严格调控，表达盒的N端带有引导分泌表达的带α-factor信号肽序列，表达产物可分泌到上清，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因，给筛选转化子的工作带来很大的便利。再者甲醇营养型酵母表达系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点，其宿主菌巴斯德毕赤酵母自身蛋白分泌量少，下游分离纯化操作易行，能大规模发酵生产，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种活性高的犬重组干扰素-α6。本专利技术的另一目的在于提供该犬重组干扰素-α6的制备方法。本专利技术的第三个目的在于提供上述方法制得的犬重组干扰素-α6的应用。为了提高蛋白的表达量，本专利技术利用毕赤酵母偏爱密码子对所述核酸序列进行了密码子优化。为了避免翻译出来的mRNA的GC含量过高、mRNA的二级结构影响翻译的效率，本专利技术对某些氨基酸使用次偏爱密码，前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常接近，氨基酸序列原序列不变，在某些很特殊的情况下，为了减少或增加酶切位点，某些位置的序列做适当的序列调整。由此，本专利技术优化设计了密码子优化了的犬干扰素-α6基因，其序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供一种犬重组干扰素-α6，其氨基酸序列为：a)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或b)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术提供了编码所述犬重组干扰素-α6的基因，是如下a)或b)：a)其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示；或b)由SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码犬重组干扰素-α6的核苷酸序列。本专利技术提供了含有上述基因的重组表达载体。其中，上述重组表达载体含有醇氧化酶启动子(AOX)或甲醛脱氢酶启动子(Formatedehydrogenase，FMD)。优选地，上述载体含有醇氧化酶启动子(AOX)。在本专利技术的实施例中，构建的重组表达载体为pPICZαA-CaIFN-α6。本专利技术提供了含有所述基因或所述重组表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。更优选地，所述毕赤酵母细胞为毕赤酵母菌株X-33。本专利技术提供了上述密码子优化了的犬干扰素-α6基因或所述重组表达载体或所述的宿主细胞在制备广谱抗病毒药物中的应用。进一步地，所述病毒为犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒、水泡性口炎病毒。本专利技术提供了上述密码子优化了的犬干扰素-α6基因或所述重组表达载体或所述的宿主细胞在制备广谱抗病毒制剂中的应用。进一步地，所述病毒为犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒、水泡性口炎病毒。本专利技术提供了含有上述密码子优化了的犬重组干扰素-α6基因或其编码蛋白的生物制剂或药物。本专利技术还提供了一种制备犬干扰素-α6的方法，是将密码子优化后的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的犬干扰素-α6基因定向克隆至质粒中构建重组质粒，重组质粒转化至毕赤酵母感受态细胞，制备重组菌，通过确定甲醇诱导条件、诱导浓度、诱导时间，蛋白收获时间等优化酵母的发酵、表达，采用超滤浓缩后ChelatingSFF(Ni)亲和层析的方法进行纯化，有效提高了产物的产量，从而获得高产量、高纯度的犬重组干扰素-α6。确定重组酵母工程菌X-33/pPICZαA-CaIFN-α6的最佳诱导表达条件是，将克隆的重组菌X-33/pPICZαA-CaIFN-α6接种于20-30mlYPD培养基中，30℃250rpm/min培养16～18h左右，至菌体OD600值为6左右时，分别1500～3000g室温离心5min，弃去培养基，收集菌体。菌体沉淀用20mLBMMY培养基重悬至OD600值为1，28℃，250rpm/min培养，且每隔24h补加甲醇，甲醇终浓度1％。诱导培养96h后，收集培养上清液进行超滤浓缩后ChelatingSFF(Ni)亲和层析的方法进行纯化。在本专利技术的实施例中，是将密码子优化的犬IFN-α6的基因定向克隆至pPICZαA中构建重组质粒pPICZαA-CaIFN-α6，转化至Trans5α感受态细胞中，从而获得重组菌。以含Zeocin(25ug/ml)的低盐LB平板筛选转化子，并进行PCR鉴定，送公司测序。制备毕赤酵母菌株X-33的感受态细胞，将SacI单酶切的线性化重组质粒经电穿孔转化至感受态细胞，涂板于MD平板，30℃2-3天，挑单克隆点种至MD和MM平板，筛选Mut+型转化子，然后涂布于含100μg/ml、250μg/ml和500μg/mlZeocin的YPD平板，利用抗性筛选高拷贝的转化子。挑取单克隆接种于BMGY培养基中，30℃，250rpm/min培养18h左右，至菌体OD600达到2～6，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬，稀释至OD600值为1.0～2.0，30℃，250rpm/min培养4～5天，每隔24h补加100％甲醇至终浓度为0.5％、1％、1.5％、2％，并在0、24、48、72、96、120h分别取10ml菌液培养上清，进行超滤浓缩，通过SDS-PAGE分析表达产物量，以确定重组酵母工程菌表达的最佳条件，实现重组酵母工程菌的最佳表达。通过SDS-PAGE分析及BCA法对表达的目的蛋白进行定量。采用Westernblot鉴定表达的目的蛋白。采用MDCK-VSV系统测定犬重组干扰素-α6的抗病毒活性。采用表达的犬重组干扰素-α6按照20万IU/kg剂量皮下注射病犬，连续注射6天，用于预防及治疗犬的犬瘟热、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬重组干扰素‑α6，其特征在于，其氨基酸序列为：a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或b)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2018.01.12 CN 20181003246531.一种犬重组干扰素-α6，其特征在于，其氨基酸序列为：a)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或b)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述犬重组干扰素-α6的基因，其特征在于，是如下a)或b)：a)其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示；或b)由SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码犬重组干扰素-α6的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。4.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述重组表达载体的宿主细胞。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其为毕赤酵母细胞。6.权利要求2所述的基因或权利要求3所述重组表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾红，鑫婷，郭晓宇，侯绍华，朱鸿飞，姜一曈，宋天琪，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11