鳜鱼雄性四倍体纯系高效育成方法技术

本发明专利技术公开了一种鳜鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：他莫昔芬抑制剂配备、他莫昔芬注射液的配制、注射处理母本、冷休克+静水压处理、雌激素抑制剂溶液的配制、获得鳜鱼雄性四倍体纯系。通过此方法，可获得100%的鳜鱼雄性四倍体纯系，有效提高了四倍体的育成率及出苗率，相比杂交而言，能获得纯度更高、后代更为稳定的雄性四倍体鱼系，为不育三倍体鳜鱼的育成奠定了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鳜鱼的多倍体繁育方法，具体涉及鳜鱼雄性四倍体纯系高效育成方法。
技术介绍
鳜鱼，又分为翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜等。身体侧扁，背部隆起，身体较厚，尖头，其肉质细嫩，刺少肉多，肉呈瓣状，味道鲜美，实为鱼中之佳品。三倍体鳜鱼的不育特征，使其在生长速度、抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出更为显著的优势。现有技术中，不育三倍体鳜鱼是通过四倍体鳜鱼与二倍体鳜鱼倍间杂交获得，但要获得98%以上的三倍体鱼，那么就需要建立遗传稳定、纯度极高的四倍体鱼系。在鱼类遗传育种中，通常利用冷/热休克，或通过杂交等方法抑制受精卵的第一次有丝分裂或直接异源染色体加倍，制备出同源或异源四倍体鱼，其中冷休克一般是与静水压处理一起，难以获得较高纯度的四倍体系，而热休克的方式虽然易于操作，同样，难以获得纯度高的四倍体系；而杂交的方法虽然纯度高，但成功率低、周期长。此外，上述这些方法制备的四倍体鱼，有些可育、有些又不可育，同时也可能存在基因混杂现象（异源四倍体），容易造成生物危险。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种方法稳定、种群纯度高达100%的鳜鱼雄性四倍体纯系高效育成方法。为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：鳜鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬抑制剂配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为80～120mg/ml，待用；（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例为1ml他莫昔芬母液加入到240～400ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液待用；催产剂溶液是通过将脑垂体用0.9%生理盐水稀释配制而得，催产剂溶液中脑垂体的剂量为0.01-0.05mg/g；（3）注射处理母本：在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为100～280μg/kg；（4）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1～1.0℃的冷水中，静水压压力为250～340Kg/cm2，持续时间为3～5min；（5）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为150～300mg/l，睾酮的浓度为50～140mg/l；（6）取步骤（4）处理后的受精卵放入按步骤（5）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10～30s，然后取出放于孵化器中正常孵化；从而获得100%鳜鱼雄性四倍体纯系。本专利技术的优点：1、本专利技术中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA复制和促雄性的双重作用的同时，推延了受精卵第一次卵裂的时间（3-5min）、提高了所有受精卵第一次卵裂的同步程度（可达99%），为操作下一步提供时间保障和奠定了染色体加倍的基础；2、在受精卵一次卵裂时采用冷休克与较低的静水压（低于常用的350kg/cm2），以及较短的处理时间（低于5min），有效减少冷休克时间过长、压力过高对受精卵的破坏程度，提高受精卵的成活率；3、雌激素抑制剂溶液浸泡，再一次强化与保证雄性转化率。因而通过此方法，可获得100%的鳜鱼雄性四倍体纯系，有效提高了四倍体的育成率及出苗率，相比杂交而言，能获得纯度更高、后代更为稳定的雄性四倍体鱼系，为不育三倍体鳜鱼的育成奠定了坚实的基础。具体实施方式现结合具体实施例，对本专利技术作进一步描述。实施例一翘嘴鳜雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬抑制剂配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为120mg/ml，待用；（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例为1ml他莫昔芬母液加入到240ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液，注射液中他莫昔芬的浓度约为0.5mg/ml，待用；（3）注射处理母本：在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为220μg/kg；（4）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为0℃的冷水中，静水压压力为310Kg/cm2，持续时间为5min；（5）雌激素抑制剂配制：将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为250mg/l，睾酮的浓度为110mg/l；（6）取步骤（4）处理后的受精卵放入按步骤（5）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡30s，然后取出放于孵化器中正常孵化；从而获得100%鳜鱼雄性四倍体纯系。实施例二大眼鳜鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬抑制剂配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为120mg/ml，待用；（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例为1ml他莫昔芬母液加入到400ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液，注射液中他莫昔芬的浓度为0.2mg/ml，待用；（3）注射处理母本：在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为280μg/kg；（4）冷休克+静水压处理：在一次卵裂前2～5min，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1℃的冷水中，静水压压力为280Kg/cm2，持续时间为3min；（5）雌激素抑制剂配制：将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为300mg/l，睾酮的浓度为140mg/l；（6）取步骤（4）处理后的受精卵放入按步骤（5）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10s，然后取出放于孵化器中正常孵化；从而获得100%鳜鱼雄性四倍体纯系。上述两个实施例仅为本专利技术的优选方案之二，并不能限制本专利技术的保护范围，任意与本专利技术等同或相似的技术手段视为本专利技术的保护范围。以下附上本专利技术部分处理方式及结果统计。附：鳜鱼雄性四倍体育成结果统计注：上述结果是在注射液中他莫昔芬的浓度为0.2mg/ml的条件下常温浸泡10S，静水压处理3分钟所取得的结果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
鳜鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬抑制剂配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为80～120mg/ml，待用；（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例为1ml他莫昔芬母液加入到240～400ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液待用；催产剂溶液是通过将脑垂体用0.9%生理盐水稀释配制而得，催产剂溶液中脑垂体的剂量为0.01‑0.05mg/g；（3）注射处理母本：在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为100～280μg/kg；（4）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为‑1～1.0℃的冷水中，静水压压力为250～340Kg/cm2，持续时间为3～5min；（5）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为150～300mg/l，睾酮的浓度为50～140mg/l；（6）取步骤（4）处理后的受精卵放入按步骤（5）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10～30s，然后取出放于孵化器中正常孵化；从而获得100%鳜鱼雄性四倍体纯系。...

【技术特征摘要】
1.鳜鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：（1）他莫昔芬抑制剂配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为80～120mg/ml，待用；（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例为1ml他莫昔芬母液加入到240～400ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液待用；催产剂溶液是通过将脑垂体用0.9%生理盐水稀释配制而得，催产剂溶液中脑垂体的剂量为0.01-0.05mg/g；（3）注射处理母本：在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为100～280μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨品红，刘飞，石彭灵，
申请(专利权)人：湖南文理学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43