用于形成连接产物的方法和组合物技术

在一些方面，本公开内容提供了用于形成包含单链多核苷酸的连接产物的方法。由本公开内容的各个方面形成的连接产物可用于各种应用，包括但不限于序列分析。在一些实施方案中，所述连接产物包含无细胞多核苷酸。在一些方面，本公开内容提供了与本文方法一致的反应混合物、试剂盒和复合体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于形成连接产物的方法和组合物交叉引用本申请要求于2015年12月3日提交的美国临时申请号62/262,883的权益，该美国临时申请通过引用并入本文。
技术介绍
形成多核苷酸连接产物可以具有多种用途，诸如检查靶多核苷酸、生成表达载体的分子克隆方法、cDNA文库构建以及作为扩增和测序反应的前置步骤。连接产物可以由双链核酸和单链核酸二者形成。双链核酸可以通过“黏端”连接或“平端”连接来进行连接。在黏端连接中，包含末端突出端的交错末端可以与连接配偶体杂交。在平端连接中，末端突出端不存在，并且成功的连接依赖于5’端和3’端的瞬态缔合。一般而言，平端连接比黏端连接效率低，并且可以应用各种优化如调整浓度、温育时间和温度来提高效率。还可以连接单链多核苷酸。然而，缺乏实施这种反应的有效方法。现有的单链DNA连接方法可能会有动力学缓慢、产率不佳以及严重的核苷酸偏好的问题。
技术实现思路
鉴于上述情况，需要提高利用单链多核苷酸靶标生成连接产物的效率。本公开内容的方法和组合物满足了该需求，并且还提供了额外的益处。在一个方面，本公开内容提供了一种用于鉴定包含多个无细胞DNA多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法。在一些实施方案中，该方法包括(a)形成多个连接产物，其中所述连接产物中的单独的成员通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接而形成，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的捕获探针的第二区段，其中单独的衔接子包含独特的条形码序列；(b)将所述多个连接产物进行环化以产生多个环状靶多核苷酸；(c)生成多个多联体，其中所述多个多联体中的单独的多联体通过延伸根据序列互补性与靶多核苷酸杂交的第一引物而形成；(d)由所述多联体生成多个延伸产物，其中所述多个延伸产物中的单独的延伸产物通过延伸根据序列互补性与多联体杂交的第二引物而形成；(e)对多个延伸产物进行测序以产生测序读取；以及(f)当(i)在含有至少出现两次的序列差异的延伸产物的测序读取中检测到序列差异，并且(ii)该序列差异在具有不同的条形码序列的至少两个不同的测序读取中出现时，将测序读取与参考序列之间的序列差异鉴定为序列变体。在一个方面，用于鉴定包含多个无细胞DNA多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法包括：(a)形成多个连接产物，其中所述连接产物中的单独的成员通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接而形成，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的所述捕获探针的第二区段；(b)将所述多个连接产物进行环化以产生多个环状靶多核苷酸，其中单独的环状靶多核苷酸包含(i)无细胞DNA多核苷酸的5’端与单链衔接子的3’端之间的第一接点，以及(ii)所述无细胞DNA多核苷酸的3’端与所述单链衔接子的5’端之间的第二接点；(c)生成多个多联体，其中所述多个多联体中的单独的多联体通过延伸根据序列互补性与靶多核苷酸杂交的第一引物而形成；(d)由所述多联体生成多个延伸产物，其中所述多个延伸产物中的单独的延伸产物通过延伸根据序列互补性与所述多联体杂交的第二引物而形成；(e)对多个延伸产物进行测序以产生测序读取；(f)当(i)在含有至少出现两次的序列差异的延伸产物的测序读取中检测到序列差异，并且(ii)该序列差异在具有不同的第一接点和第二接点的至少两个不同的测序读取中出现时，将测序读取与参考序列之间的序列差异鉴定为序列变体。在一些实施方案中，本文公开的用于鉴定序列变体的方法包括在(b)中进行环化之前降解所述捕获探针。在一些实施方案中，降解所述捕获探针包括酶促降解所述捕获探针。在一些实施方案中，酶促降解所述捕获探针通过内切核酸酶而实现。在一些实施方案中，所述捕获探针包含标签。在一些实施方案中，用于鉴定序列变体的方法进一步包括通过将所述多核苷酸复合体直接或间接地固定到包含特异性结合所述标签的选择性结合剂的支持物上来分离所述多核苷酸复合体。在一些实施方案中，所述分离发生在步骤(c)之前。在一些实施方案中，所述支持物包含磁珠。在一些实施方案中，所述序列变体包括单核苷酸多态性、单核苷酸变体、插入、缺失、重复、倒位、易位、拷贝数变异、基因融合和指示甲基化的突变中的至少一种。在一些实施方案中，本文公开的用于鉴定序列变体的方法包括使所述连接产物与亚硫酸氢盐相接触以将所述连接产物中的未甲基化的胞嘧啶修饰为尿苷。在一些实施方案中，所述序列变体包括C至T突变。在一些实施方案中，所述第一引物包含不根据序列互补性与所述靶多核苷酸杂交的第一5’端。在一些实施方案中，所述第二引物包含不根据序列互补性与所述多联体杂交的第二5’端。在一些实施方案中，用于鉴定序列变体的方法进一步包括使用包含所述第一5’端的至少一部分的序列的第三引物和包含所述第二5’端的至少一部分的序列的第四引物来扩增(d)中的所述多个延伸产物。在一些实施方案中，所述第一引物与所述无细胞DNA多核苷酸的至少一个区段的序列杂交。在一些实施方案中，所述第一引物包含基因特异性序列。在一些实施方案中，所述第一引物包含随机序列。在一些实施方案中，所述第二引物与同所述无细胞DNA多核苷酸的至少一个区段互补的序列杂交。在一些实施方案中，所述第二引物包含基因特异性序列。在一些实施方案中，所述第二引物包含随机序列。在一些实施方案中，所述第一引物与所述单链衔接子的至少一个区段的序列杂交。在一些实施方案中，所述第二引物与同所述单链衔接子的至少一个区段互补的序列杂交。在一些实施方案中，所述第一引物包含条形码序列。在一些实施方案中，所述第二引物包含条形码序列。在一些实施方案中，所述捕获探针包含双链核酸，并且在形成多核苷酸复合体之前，将所述双链核酸分离成两个单链捕获探针。在一些实施方案中，在(a)中的所述连接之前或与之同时，使用所述捕获探针作为模板延伸所述无细胞DNA，以补平无细胞DNA多核苷酸与单链衔接子之间的序列空隙。在一些实施方案中，在(a)中的所述连接之前或与之同时，使用所述捕获探针作为模板延伸所述单链衔接子，以补平无细胞DNA多核苷酸与单链衔接子之间的序列空隙。在一些实施方案中，所述无细胞DNA多核苷酸在5’端包含与所述捕获探针缺乏序列互补性的区段。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在(a)中的所述连接之前或与之同时，用内切核酸酶切割与所述捕获探针缺乏序列互补性的所述无细胞DNA多核苷酸的区段。在一些实施方案中，所述无细胞DNA多核苷酸在3’端包含与所述捕获探针缺乏序列互补性的区段。在一些实施方案中，所述方法包括在(a)中的所述连接之前或与之同时，用内切核酸酶切割与所述捕获探针缺乏序列互补性的所述无细胞DNA多核苷酸的区段。在一个方面，本公开内容提供了一种用于扩增无细胞DNA的方法，该方法包括(a)通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接来形成连接产物，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的捕获探针的第二区段；(b)降解或选择性地去除所述捕获探针；(c)将所述连接产物进行环化以产生环状靶多核苷酸；(d)通过延伸根据序列互补性与靶多核苷酸杂交的第一引物生成包含来自所述环状靶多核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴定包含多个无细胞DNA多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，其包括：(a)形成多个连接产物，其中所述连接产物中的单独的成员通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接而形成，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的所述捕获探针的第二区段，其中单独的衔接子包含独特的条形码序列；(b)将所述多个连接产物进行环化以产生多个环状靶多核苷酸；(c)生成多个多联体，其中所述多个多联体中的单独的多联体通过延伸根据序列互补性与靶多核苷酸杂交的第一引物而形成；(d)由所述多联体生成多个延伸产物，其中所述多个延伸产物中的单独的延伸产物通过延伸根据序列互补性与多联体杂交的第二引物而形成；(e)对多个所述延伸产物进行测序以产生测序读取；以及(f)当(i)在含有至少出现两次的序列差异的延伸产物的测序读取中检测到序列差异，并且(ii)所述序列差异在具有不同条形码序列的至少两个不同的测序读取中出现时，将测序读取与参考序列之间的序列差异鉴定为所述序列变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.03 US 62/262,8831.一种用于鉴定包含多个无细胞DNA多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，其包括：(a)形成多个连接产物，其中所述连接产物中的单独的成员通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接而形成，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的所述捕获探针的第二区段，其中单独的衔接子包含独特的条形码序列；(b)将所述多个连接产物进行环化以产生多个环状靶多核苷酸；(c)生成多个多联体，其中所述多个多联体中的单独的多联体通过延伸根据序列互补性与靶多核苷酸杂交的第一引物而形成；(d)由所述多联体生成多个延伸产物，其中所述多个延伸产物中的单独的延伸产物通过延伸根据序列互补性与多联体杂交的第二引物而形成；(e)对多个所述延伸产物进行测序以产生测序读取；以及(f)当(i)在含有至少出现两次的序列差异的延伸产物的测序读取中检测到序列差异，并且(ii)所述序列差异在具有不同条形码序列的至少两个不同的测序读取中出现时，将测序读取与参考序列之间的序列差异鉴定为所述序列变体。2.一种用于鉴定包含多个无细胞DNA多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，其包括：(a)形成多个连接产物，其中所述连接产物中的单独的成员通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接而形成，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的所述捕获探针的第二区段；(b)将所述多个连接产物进行环化以产生多个环状靶多核苷酸，其中单独的环状靶多核苷酸包含(i)无细胞DNA多核苷酸的5’端与单链衔接子的3’端之间的第一接点，以及(ii)所述无细胞DNA多核苷酸的3’端与所述单链衔接子的5’端之间的第二接点；(c)生成多个多联体，其中所述多个多联体中的单独的多联体通过延伸根据序列互补性与靶多核苷酸杂交的第一引物而形成；(d)由所述多联体生成多个延伸产物，其中所述多个延伸产物中的单独的延伸产物通过延伸根据序列互补性与所述多联体杂交的第二引物而形成；(e)对多个所述延伸产物进行测序以产生测序读取；(f)当(i)在含有至少出现两次的序列差异的延伸产物的测序读取中检测到序列差异，并且(ii)所述序列差异在具有不同的第一接点和第二接点的至少两个不同的测序读取中出现时，将测序读取与参考序列之间的序列差异鉴定为所述序列变体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在(b)中进行环化之前降解所述捕获探针。4.根据权利要求3所述的方法，其中降解所述捕获探针包括酶促降解所述捕获探针。5.根据权利要求4所述的方法，其中酶促降解所述捕获探针通过内切核酸酶而实现。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述捕获探针包含标签。7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括通过将所述多核苷酸复合体直接或间接地固定到包含特异性结合所述标签的选择性结合剂的支持物上来分离所述多核苷酸复合体。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述分离发生在步骤(c)之前。9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述序列变体包括单核苷酸多态性、单核苷酸变体、插入、缺失、重复、倒位、易位、拷贝数变异、基因融合和指示甲基化的突变中的至少一种。10.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括使所述连接产物与亚硫酸氢盐相接触以将所述连接产物中的未甲基化的胞嘧啶修饰为尿苷。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述序列变体包括C至T突变。12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一引物包含不根据序列互补性与所述靶多核苷酸杂交的第一5’端。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二引物包含不根据序列互补性与所述多联体杂交的第二5’端。14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括使用包含所述第一5’端的至少一部分的序列的第三引物和包含所述第二5’端的至少一部分的序列的第四引物来扩增(d)中的所述多个延伸产物。15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一引物与所述无细胞DNA多核苷酸的至少一个区段的序列杂交。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一引物包含基因特异性序列。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一引物包含随机序列。18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二引物与同所述无细胞DNA多核苷酸的至少一个区段互补的序列杂交。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二引物包含基因特异性序列。20.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二引物包含随机序列。21.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一引物与所述单链衔接子的至少一个区段的序列杂交。22.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二引物与同所述单链衔接子的至少一个区段互补的序列杂交。23.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一引物包含条形码序列。24.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二引物包含条形码序列。25.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述捕获探针包含双链核酸，并且在形成多核苷酸复合体之前，将所述双链核酸分离成两个单链捕获探针。26.根据权利要求1或2所述的方法，其中在(a)中的所述连接之前或与之同时，使用所述捕获探针作为模板延伸所述无细胞DNA，以补平所述无细胞DNA多核苷酸与所述单链衔接子之间的序列空隙。27.根据权利要求1或2所述的方法，其中在(a)中的所述连接之前或与之同时，使用所述捕获探针作为模板延伸所述单链衔接子，以补平所述无细胞DNA多核苷酸与所述单链衔接子之间的序列空隙。28.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述无细胞DNA多核苷酸在5’端包含与所述捕获探针缺乏序列互补性的区段。29.根据权利要求28所述的方法，其进一步包括在(a)中的所述连接之前或与之同时，用内切核酸酶切割与所述捕获探针缺乏序列互补性的所述无细胞DNA多核苷酸的区段。30.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述无细胞DNA多核苷酸在3’端包含与所述捕获探针缺乏序列互补性的区段。31.根据权利要求30所述的方法，其进一步包括在(a)中的所述连接之前或与之同时，用内切核酸酶切割与所述捕获探针缺乏序列互补性的所述无细胞DNA多核苷酸的区段。32.一种用于扩增无细胞DNA的方法，其包括：(a)通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接来形成连接产物，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的所述捕获探针的第二区段；(b)降解或选择性地去除所述捕获探针；(c)将所述连接产物进行环化以产生环状靶多核苷酸；(d)通过延伸根据序列互补性与所述靶多核苷酸杂交的第一引物生成包含来自所述环状靶多核苷酸的单链多核苷酸的多联体；以及(e)通过延伸根据序列互补性与所述多联体杂交的第二引物生成包含一个或多个拷贝的所述靶多核苷酸的多个延伸产物。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一引物包含不根据序列互补性与所述靶多核苷酸杂交的第一5’端。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第二引物包含不根据序列互补性与所述多联体杂交的第二5’端。35.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括使用包含所述第一5’端的至少一部分的序列的第三引物和包含所述第二5’端的至少一部分的序列的第四引物来扩增(d)中的所述多个延伸产物。36.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一引物与所述无细胞DNA多核苷酸的至少一个区段的序列杂交。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一引物包含基因特异性序列。38.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一引物包含随机序列。39.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二引物与同所述无细胞DNA多核苷酸的至少一个区段互补的序列杂交。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述第二引物包含基因特异性序列。41.根据权利要求39所述的方法，其中所述第二引物包含随机序列。42.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一引物与所述单链衔接子的至少一个区段的序列杂交。43.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二引物与同所述单链衔接子的至少一个区段互补的序列杂交。44.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一引物包含条形码序列。45.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二引物包含条形码序列。46.根据权利要求32所述的方法，其中所述捕获探针包含双链核酸，并且在形成多核苷酸复合体之前，将所述双链核酸分离成两个单链捕获探针。47.一种进行滚环扩增的方法，其包括：(a)提供包含靶多核苷酸的环状多核苷酸，其中所述环状多核苷酸通过以下步骤形成：(i)将无细胞DNA多核苷酸和单链衔接子与捕获探针混合以形成多核苷酸复合体，其中所述捕获探针的第一区段根据序列互补性与所述无细胞DNA多核苷酸杂交，并且所述捕获探针的第二区段根据序列互补性与所述单链衔接子杂交；(ii)将所述无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接，从而形成连接产物；(iii)降解或选择性地去除所述捕获探针；以及(iv)将所述连接产物进行环化以产生环状靶多核苷酸；(b)使扩增反应混合物经历多个循环的滚环扩增以生成包含多联体的多个扩增产物，其中所述扩增反应混合物包含(i)具有链置换活性的聚合酶，(ii)(a)中的环状靶多核苷酸，以及(iii)引物；其中所述多个循环的滚环扩增中的每个循环均包括在变性温度下的变性、在退火温度下的引物退火以及在延伸温度下持续给定延伸时间段的引物延伸，以生成包含多联体的所述多个扩增产物；并且其中生成的所述多个扩增产物的特征在于，与通过利用变性和引物退火条件相当但延伸时间段相当于所述多个循环的延伸时间段之和的一个扩增循环生成的多个扩增产物相比，该扩增产物含有更高比例的具有至少两个拷贝的所述靶多核苷酸的多联体。48.一种使用捕获探针形成第一单链多核苷酸和第二单链多核苷酸的连接产物的方法，所述方法包括：(a)将所...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁莉，林盛榕，马利克·法哈姆，
申请(专利权)人：安可济控股有限公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛,KY