一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的非动物源培养基及其培养方法技术

本发明专利技术公开了一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的非动物源培养基，它包括液体培养基和固体培养基，其中，液体培养基成分：非动物源有机氮源8～30g/L、氯化钾0.2～0.8g/L、味精1～2g/L、氯化铵1.5～3g/L、磷酸氢二钠0.5～0.8g/L、磷酸二氢钠0.15～0.3g/L、胱氨酸0.01～0.03g/L、硫酸镁0.3～0.5g/L、葡萄糖6～8g/L；固体培养基在前述液体培养基的基础上添加10～20g/L的琼脂。本发明专利技术还公开了前述培养基的制备方法和用途。本发明专利技术培养基可以高效培养A群奈瑟氏脑膜炎球菌，获得的多糖含量高，并且培养基为非动物源培养基，安全性好，应用前景优良。

A non animal source medium for A group Neisseria meningococcal and its culture method

The invention discloses a non-animal source culture medium for group A Neisseria meningococcus, which comprises a liquid culture medium and a solid culture medium. The liquid culture medium consists of non-animal organic nitrogen source 8-30 g/L, potassium chloride 0.2-0.8 g/L, monosodium glutamate 1-2 g/L, ammonium chloride 1.5-3 g/L, disodium hydrogen phosphate 0.5-0.8 g/L, and dihydrogen phosphate. Sodium 0.15-0.3 g/L, cystine 0.01-0.03 g/L, magnesium sulfate 0.3-0.5 g/L, glucose 6-8 g/L, and solid medium added 10-20 g/L agar on the basis of the liquid medium. The invention also discloses the preparation method and the use of the above culture medium. The culture medium of the invention can efficiently culture group A Neisseria meningococcus, and the polysaccharide content obtained is high, and the culture medium is a non-animal source medium, with good safety and good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的非动物源培养基及其培养方法
本专利技术涉及一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的非动物源培养基及其培养方法。
技术介绍
脑膜炎球菌性脑膜炎(meningococcalmeningitis)又称流行性脑脊髓膜炎(Neisseriameningitides，NM)，简称流脑，是由奈瑟氏脑膜炎球菌引起的一种严重危害人类健康的呼吸道传染病。易感人群主要为婴幼儿，以暴发型病死率最高，可达40％－60％。根据荚膜多糖在化学和血清学上的不同，脑膜炎球菌分为若干群，其中A、C、Y、W135群是常见的致病菌。脑膜炎球菌除了引起细菌性脑膜炎外还可引起败血症，是一类危害性极大的致病菌。脑膜炎球菌荚膜多糖是其致病的主要毒力因子，因其具有较强的抗原性，已被作为保护性抗原用于流脑疫苗的制备和生产。在当今世界儿童传染病的防治目标中，流脑的免疫预防仍然是重要课题之一。我国于1980年正式生产A群NM多糖疫苗，推广应用以来，获得满意的免疫效果。但现有的A群NM疫苗生产工艺中，采用了动物源性的发酵原料；由于动物源原材料可能带有朊病毒等致病因子的潜在风险，国际生物制品行业发展的趋势要求尽量避免使用动物源性原材料，有效降低生物制品风险。流脑A群疫苗生产厂家一般采用将A群奈瑟氏脑膜炎球菌种开启到10％羊血巧克力琼脂培养基(含羊血成分)，再传到改良半综合培养基(含牛源酸水解酪蛋白)，最后接种到改良半综合液体培养基(含牛源酸水解酪蛋白)，这些在培养基中接入的动物血液成分和动物来源的氮源成分均存在潜在的感染动物携带病毒的风险，而且成分复杂，给疫苗带来不安全的风险。据现场观察资料，疫苗接种后的全身中强反应率为3.3％；局部中强反应率约为6％。因此，需要对现有的A群奈瑟氏脑膜炎球菌的培养基进行改进，提供一种能够高效培养A群奈瑟氏脑膜炎球菌的无动物源性原料的培养基。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种无动物来源成分的A群奈瑟氏脑膜炎球菌培养基及其制备方法和应用。本专利技术A群奈瑟氏脑膜炎球菌的非动物源培养基，它包括液体培养基和固体培养基，其中，液体培养基为每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，其余为水；固体培养基每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，琼脂10～20g，其余为水。其中，所述非动物源有机氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨的一种或多种的组合。优选地，所述非动物源有机氮源为酵母粉或者大豆蛋白胨。优选地，所述非动物源有机氮源为酵母粉和大豆蛋白胨的混合物，二者的重量比例为1:1；或者，所述非动物源有机氮源为酵母粉和大米蛋白胨的混合物，二者的重量比例为1:1。本专利技术还提供了一种制备前述培养基的制备方法，所述液体培养基按照如下步骤制备：按重量配比称取原料，混匀，即可；所述液体培养基按照如下步骤制备：按重量配比称取原料，混合，加热溶解，凝固，即可。本专利技术还提供了前述培养基在A群奈瑟氏脑膜炎球菌的培养中的用途。本专利技术还提供了一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的培养方法，它是采用前述培养基进行培养。所述培养方法的步骤如下：(1)菌种开启：启开A群奈瑟氏脑膜炎球菌工作种子批菌种，接种于固体培养基，35℃～37℃5％CO2培养18～24小时，得一代种子；(2)传二代培养：将一代种子接种于固体培养基，35℃～37℃培养18～24小时，得二代种子；(3)传三代培养：将二代种子接种于摇瓶的液体培养基中，起始OD550值为0.1～0.4，35℃～37℃培养3～8小时，得三代菌种菌液；(4)传四代培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐的液体培养基中，培养温度35℃～37℃，pH值为7.0～7.2，培养时间3～8小时，OD550值达到1.0以上时转种，得四代菌种菌液；(5)发酵罐培养：将四代菌种菌液接种于发酵罐的液体培养基中，培养温度35℃～37℃，pH值为7.0～7.2，在发酵4小时后、OD550达到2.5以上、葡萄糖浓度低于20mmol/L时开始补加20％葡萄糖溶液，并控制发酵液中葡萄糖浓度为18～30mmol/L，在补加20％葡萄糖溶液的同时补加等体积的非动物源有机氮源溶液；培养为时间6～10小时；所述非动物源有机氮源溶液每1000ml培养基含有非动物源有机氮源20g，其余为水。步骤(5)中，所述非动物源有机氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨的一种或多种的组合。本专利技术将目前疫苗生产所采用的A群奈瑟氏脑膜炎球菌发酵培养基中动物源性的成分用非动物来源的成分替代并通过配方优化，获取无动物源性成分的培养基，避免了因动物源成份携带病原体给疫苗安全带来的风险，提高了疫苗的安全性，减少疫苗接种的副反应；另外，本研究根据无动物源培养基的特性，对培养工艺进行了相应改进，使培养工艺标准化，提高了批次间的稳定性。比较两种培养基发酵培养的A群奈瑟氏脑膜炎球菌生长浓度、发酵培养液中多糖含量和最终精糖收量发现，用无动物源培养基培养A群奈瑟氏脑膜炎球菌能够获得与用动物源培养基培养相同甚至更好的效果。本专利技术克服了现有技术的缺点，提供一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的无动物源培养基，该培养基为无动物源成分，完全避免了因动物携带病原体给疫苗安全带来的风险，提高了疫苗的安全性，减少疫苗接种的副反应，并且培养效果好。下面通过具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明，但是并不是对本专利技术的限制，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。具体实施方式实施例1本专利技术无动物来源成分的A群奈瑟氏脑膜炎球菌培养基的制备本专利技术A群奈瑟氏脑膜炎球菌无动物源培养基成分包括：氯化钾、非动物源有机氮源、味精、氯化铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、胱氨酸、硫酸镁、葡萄糖；培养方法包括：菌种开启、传二代、传三代、种子罐培养、大罐培养。液体培养基配方：每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，其余为水。取上述原料，混匀，灭菌，即可。固体培养基配方：每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，琼脂10～20g，其余为水。取上述原料，混合，加热溶解，凝固，灭菌，即可。其中，非动物源有机氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨的一种或多种组合。实施例2本专利技术培养基的筛选实验1、实验方法取A群奈瑟氏脑膜炎球菌，进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的非动物源培养基，其特征在于：它包括液体培养基和固体培养基，其中，液体培养基为每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，其余为水；固体培养基每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，琼脂10～20g，其余为水。

【技术特征摘要】
1.一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的非动物源培养基，其特征在于：它包括液体培养基和固体培养基，其中，液体培养基为每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，其余为水；固体培养基每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，琼脂10～20g，其余为水。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述非动物源有机氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨的一种或多种的组合。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述非动物源有机氮源为酵母粉或者大豆蛋白胨。4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述非动物源有机氮源为酵母粉和大豆蛋白胨的混合物，二者的重量比例为1:1；或者，所述非动物源有机氮源为酵母粉和大米蛋白胨的混合物，二者的重量比例为1:1。5.一种制备权利要求1～4任意一项所述培养基的制备方法，其特征在于：所述液体培养基按照如下步骤制备：按重量配比称取原料，混匀，即可；所述液体培养基按照如下步骤制备：按重量配比称取原料，混合，加热溶解，凝固，即可。6.权利要求1所述培养基在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，夏永，王公孝，熊慧玲，何伯强，许蓉华，刘璐，
申请(专利权)人：成都生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川,51