【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种肺炎球菌荚膜固定试剂及荚膜肿胀染色方法。
技术介绍
1、肺炎球菌，即肺炎链球菌，荚膜是肺炎球菌细胞壁外的一种特殊结构，具有黏附、抗吞噬的作用，与细菌的致病性有关。荚膜的主要化学成分为多糖，其分子组成和构型多样，形成复杂的结构，成为血清学分型的基础。由于多糖荚膜折光性低，为非离子，与染料亲和力弱，且荚膜可溶于水，因而在用水冲洗时容易被除去，采用普通方法对荚膜进行染色的效果不理想。荚膜肿胀染色试验是利用血清型特异性的抗血清与肺炎球菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物，使得荚膜肿大易于观察，用以鉴定肺炎球菌及其血清型、筛选不同荚膜厚度的肺炎球菌菌种、培养基营养判断、肺炎球菌发酵过程的质量控制等。
2、目前较好的荚膜染色方法为：使用酸性染色剂(例如苯胺黑、刚果红或墨水等)对背景进行染色，使用碱性染色剂(例如结晶紫、番红、碱性品红或亚甲基蓝等)对细菌菌体本身进行染色。两种常见的染色方法分别为媒染法和无媒染法。
3、媒染法使用了两种染料，分别为碱性染料和酸性染料。深色的酸性染料将背景染成深暗色(如苯胺黑的黑色)，菌体细胞则会被碱性染料染成另一颜色(细菌细胞因带负电荷而摄取碱性染料如结晶紫，被染成紫色)，而荚膜因不结合染料而显示为围绕在菌体细胞周围的一个清晰的晕圈。该方法需用水洗去多余的染色液。此处以苯胺黑+结晶紫对肺炎球菌荚膜染色为例简要说明该染色方法的操作步骤如下：(1)将一滴苯胺黑染液滴在干净的载玻片上，紧邻磨砂边缘；(2)取肺炎球菌将其分散到苯胺黑染液滴中；(3)另将一张干净的盖玻片
4、无媒染法主要染料为碱性染料(如结晶紫)。细胞的所有部分都会表现为所使用染液的颜色(如结晶紫的紫色)。在荚膜染色过程中没有媒染剂。采用20％硫酸铜溶液洗去多余染液，这一过程使荚膜脱色，但不会使细胞脱色。因此，荚膜表现为一个围绕在染液颜色细胞周围的透明的或极浅颜色的光晕。此处以结晶紫无媒染剂对肺炎球菌荚膜染色为例简要说明该染色方法的操作步骤如下：(1)将一滴结晶紫放置在干净的显微镜载玻片上，紧邻磨砂边缘；(2)取肺炎球菌将其分散到结晶紫染液滴中；(3)另将一张干净的盖玻片的末端置于与载有细菌的载玻片末端成一定角度的位置，将含菌染液铺展成薄膜，让薄膜晾干(需要5～7min)；(4)将载玻片倾斜，用20％硫酸铜溶液冲洗；(5)让载玻片风干几分钟，油浸状态下观察载玻片。在荚膜肿胀染色时，先加入抗血清与肺炎球菌混合(阴性对照加入生理盐水)，再进行上述操作。结果为在透明背景上寻找被清晰或淡蓝色光晕环绕的紫色细胞，光环即为荚膜。
5、但是，以上方法直接将培养的细菌与抗血清在载玻片上混匀、反应，未经固定，后续进行肿胀染色后经常会出现菌体聚集成大块团状物、并裹挟染料造成较脏的背景导致无法观测，或肺炎球菌周围染液颜色太浅无法观察到荚膜，导致不能清晰显示荚膜。并且，上述方法需要对培养的细菌立即制片、染色、观察，不能长时间保存抗原。
技术实现思路
1、为了解决现有肺炎球菌荚膜肿胀染色存在的问题，本专利技术提供了一种肺炎球菌荚膜固定试剂及荚膜肿胀染色方法。
2、本专利技术提供了一种肺炎球菌荚膜固定试剂，它是体积分数为0.8％～10％的甲醛溶液。
3、进一步地，前述的肺炎球菌荚膜固定试剂是体积分数为1％的甲醛溶液。
4、进一步地，所述甲醛溶液的溶剂为pbs缓冲液、生理盐水或水。
5、本专利技术还提供了一种肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，它包括如下步骤：
6、(1)固定：将肺炎球菌培养液与前述的固定试剂混合，对肺炎球菌进行固定，得到肺炎球菌悬液；
7、(2)加抗体：在肺炎球菌悬液中加入相应血清型的肺炎球菌特异性抗血清，混合均匀后推开成一层液体，晾干；
8、(3)染色：使用碱性染色剂进行染色后洗片，晾干；
9、(4)镜检。
10、进一步地，
11、步骤(1)中，所述肺炎球菌培养液的od值≤2.0；
12、和/或，步骤(1)中，所述肺炎球菌培养液与固定试剂的体积比为1:1。
13、进一步地，步骤(2)中，所述肺炎球菌悬液和肺炎球菌特异性抗血清的体积比为1:1。
14、进一步地，步骤(3)中，所述碱性染色剂为结晶紫、番红、碱性品红或亚甲基蓝。
15、进一步地，步骤(3)中，所述碱性染色剂为结晶紫时，染色10～60s，并用15％-20％硫酸铜溶液洗片。
16、进一步地，步骤(4)中，所述镜检为使用油镜观察。
17、进一步地，镜检后根据如下结果判断肺炎球菌的阳性或阴性：
18、肺炎球菌菌体染成紫红色或蓝紫色，菌体外周有一光亮透明的环状荚膜区，背景为浅紫红色，判定为阳性；
19、肺炎球菌菌体染成紫红色或蓝紫色，菌体外无法看到光亮透明的荚膜区，浅紫红色背景与菌体相连，判定为阴性。
20、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
21、(1)本专利技术提供了一种对肺炎球菌荚膜进行固定的固定试剂，该固定试剂对荚膜的固定效果好，可将菌体及荚膜的形态、结构和位置固定在加入固定试剂时的状态，保存了其存活状态时的形态、结构和位置；经本专利技术固定试剂固定的菌体荚膜多糖更易于结合特异性抗体形成肿胀的荚膜，该固定试剂还具有温和的锁色作用，染色后可形成均匀的、具有一定颜色深度的背景，使肿胀后的荚膜与背景、菌体反差大，荚膜清晰、明亮，而且实验重现性好。此外，若菌体样本不能及时处理，可采用本专利技术所述的固定试剂先行固定，长期保存后染色效果依然良好。
22、(2)本专利技术还提供了一种荚膜肿胀染色方法，该荚膜肿胀染色方法使用本专利技术固定试剂固定后，仅用一种染料对固定好的荚膜进行染色即可呈现出明亮的荚膜透明环，提高了肺炎球菌荚膜肿胀的质量。与其他荚膜肿胀或荚膜肿胀染色方法相比较，优点为操作简单、制作时间短、肿胀效果好、易于观察、准确度高、稳定性好，且制作好的片子可长时间室温保存而不影响观察效果。
23、综上，本专利技术提供了一种肺炎球菌荚膜固定试剂，该固定试剂具有固定荚膜和染色时锁色的效果，固定后的肺炎球菌可长期保存且不影响染色效果；本专利技术还提供一种荚膜肿胀染色方法，该方法使用本专利技术固定试剂固定后，仅用一种染料进行染色即可呈现出清晰、明亮的荚膜透明环，与其他荚膜肿胀染色方法相比较，具有显著的优势，应用前景良好。
24、显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肺炎球菌荚膜固定试剂，其特征在于：它是体积分数为0.8％～10％的甲醛溶液。
2.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜固定试剂，其特征在于：它是体积分数为1％的甲醛溶液。
3.根据权利要求1或2所述的肺炎球菌荚膜固定试剂，其特征在于：所述甲醛溶液的溶剂为PBS缓冲液、生理盐水或水。
4.一种肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：它包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：
6.根据权利要求4所述的肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：步骤(2)中，所述肺炎球菌悬液和肺炎球菌特异性抗血清的体积比为1:1。
7.根据权利要求4所述的肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：步骤(3)中，所述碱性染色剂为结晶紫、番红、碱性品红或亚甲基蓝。
8.根据权利要求4所述的肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：步骤(3)中，所述碱性染色剂为结晶紫时，染色10～60s，并用15％-20％硫酸铜溶液洗片。
9.根据权利要求4所述的肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：步
10.根据权利要求4所述的肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：镜检后根据如下结果判断肺炎球菌的阳性或阴性：
...【技术特征摘要】
1.一种肺炎球菌荚膜固定试剂，其特征在于：它是体积分数为0.8％～10％的甲醛溶液。
2.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜固定试剂，其特征在于：它是体积分数为1％的甲醛溶液。
3.根据权利要求1或2所述的肺炎球菌荚膜固定试剂，其特征在于：所述甲醛溶液的溶剂为pbs缓冲液、生理盐水或水。
4.一种肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：它包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：
6.根据权利要求4所述的肺炎球菌荚膜肿胀染色方法，其特征在于：步骤(2)中，所述肺炎球菌悬液和肺炎球...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈娟，雷云，张锐，兰芳，
申请(专利权)人：成都生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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