定量检测血清淀粉样蛋白A的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术揭示了一种定量检测SAA的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括：硝酸纤维素膜包被检测线与质控线，检测线使用SAA检测抗体，质控线使用抗SAA捕获抗体的二抗；制备结合垫，其包括：含有纳米增强型时间分辨荧光微球的PBS中，加入EDC与NHS，离心，沉淀经PBS洗涤后溶解于PBS中；SAA捕获抗体使用洗涤液离心洗涤；将洗涤后的SAA捕获抗体与溶解有荧光微球的PB混合，以使SAA捕获抗体与荧光微球偶联，将偶联后的混合液喷涂于载体。

【技术实现步骤摘要】
定量检测血清淀粉样蛋白A的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法
本专利技术涉及临床免疫学检测领域，具体涉及一种定量检测血清淀粉样蛋白A的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法。
技术介绍
血清淀粉样蛋白A(serumamyloidA，SAA)是一种急性时限反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子量约12000D。在急性时限反应中，经IL-1、IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100-1000倍，但半衰期极短，只有50分钟左右。SAA与高密度脂蛋白(HDL)有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。SAA一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。与C反应蛋白(CRP)类似，SAA的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。但是，SAA检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比C反应蛋白更确凿。研究发现，在患炎性关节炎的案例中，SAA与疾病活动性的关系最密切。同时检测C反应蛋白和SAA能提高对感染的诊断灵敏度。对于淀粉样蛋白A淀粉样变性患者，以将SAA水平回复至正常为宗旨的治疗，能改善病情。对于SAA的检测，目前使用的方法主要是化学发光法、免疫比浊、胶体金等，但是这些方法都有各自的特点及不足。化学发光方法需要大型仪器，且耗时长久，成本高昂；免疫比浊灵敏度低，准确度差；胶体金法不能定量检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高灵敏度、高特异性的SAA临床定量检测试纸条。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种定量检测SAA的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括：硝酸纤维素膜包被检测线与质控线，所述检测线使用SAA检测抗体，所述质控线使用抗SAA捕获抗体的二抗；制备结合垫，其包括：含有纳米增强型时间分辨荧光微球的PBS中，加入终浓度为10mg/ml的EDC与NHS，离心，沉淀经PBS洗涤后溶解于PBS中；SAA捕获抗体使用抗体洗涤液离心洗涤；将洗涤后的SAA捕获抗体与所述溶解有荧光微球的PBS混合，以使SAA捕获抗体与荧光微球偶联；将偶联后的混合液喷涂到载体；其中，PBS为PH6-7、浓度0.05mol/L。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，荧光微球直径为100nm-300nm。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，SAA捕获抗体与荧光微球混合的重量比是1/10-1/20。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，SAA捕获抗体与荧光微球偶联后，经封闭液封闭，然后喷涂到载体，所述封闭液含有质量百分比为0.1-1％的卡泽35及浓度为10-50mmol/ml的甘氨酸。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，抗体洗涤液为PH7-8的0.05mol/LPB缓冲液。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，载体为玻璃纤维膜。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，在抗体与荧光微球混合之后，还包括步骤：将所述SAA捕获抗体与荧光微球的混合液的PH值调整至7.2±0.2。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，每一检测线的SAA检测抗体用量为0.5-2mg。作为本专利技术一实施方式的进一步改进，每一质控线的抗SAA捕获抗体的二抗，用量为0.5-2mg。为实现上述目的，本专利技术一实施方式提供一种定量检测SAA的时间分辨荧光免疫层析试纸条，由底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，试纸条由上述的方法制得。与现有技术相比，本专利技术通过将双抗体夹心法和时间分辨荧光免疫层析技术引入SAA的检测中，结合荧光检测仪，实现了SAA的定量检测，且灵敏度高，批内、批间差小，为临床使用提供了极大便利。附图说明图1是本专利技术实施例1的标准曲线图；图2是本专利技术实施例2的标准曲线图；图3是实施例1制得的定量检测SAA的试纸条与免疫比浊法的对比测试结果相关性分析；图4是实施例2制得的定量检测SAA的试纸条与免疫比浊法的对比测试结果相关性分析。具体实施方式以下将结合附图所示的具体实施方式对本专利技术进行详细描述。但这些实施方式并不限制本专利技术，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本专利技术的保护范围内。本专利技术提供的试纸条由塑料卡壳、底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸组成。样品垫为空白玻璃纤维膜。结合垫上包被有纳米增强型时间分辨荧光微球标记的SAA捕获抗体(captureantibody)。NC膜上包被有检测带和质控带，其中，检测带固定有识别不同抗原表位的SAA检测抗体(testantibody)，质控带固定有能结合抗SAA捕获抗体的二抗。结合垫为玻璃纤维膜，其上喷涂了连接有抗体的纳米增强型时间分辨荧光微球。硝酸纤维素膜(NC膜)上包被的检测带和质控带相互平行，并且相互之间保持一定间隔。纳米增强型时间分辨荧光微球选用直径100nm-300nm的微球。试纸条装于塑料卡壳内，在湿度小于35％的环境中组装。本专利技术的试纸条由如下步骤制得：NC膜上制备检测线和质控线，检测线为SAA检测抗体(testantibody)，质控线为能结合抗SAA捕获抗体的二抗；玻璃纤维膜上喷涂连接有SAA捕获抗体(captureantibody)的纳米增强型时间分辨荧光微球，制得结合垫；将一空白的玻璃纤维膜切割成适宜尺寸的长条，作为样品垫；底板、NC膜、吸水纸、结合垫、样品垫依次交错黏贴，切割成相应尺寸，装入塑料卡壳。其中，NC膜上包被检测线、质控线的方法包括如下步骤：检测线使用SAA检测抗体，用量为每检测线0.5-2mg。抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液选择PBS+(1-10)％海藻糖+(0-5)％NaCl。质控线使用抗SAA捕获抗体的二抗，用量为每质控线0.5-2mg。高于此浓度的抗体使用稀释液稀释到浓度范围后使用，稀释液选择PBS+(1-10)％海藻糖+(0-5)％NaCl。使用定量喷膜仪以0.8-1.5ul/cm的浓度将上述二种抗体分划于NC膜上，保持两线间隔0.5cm以上。25-60℃烘干1-5小时，干燥保存。结合垫的制作方法包括如下步骤：含有纳米增强型时间分辨荧光微球的PBS中加入终浓度为10mg/ml的EDC、NHS，室温反应30min-2小时，其中，PBS为PH6-7、浓度0.05mol/L；15000-25000rpm/min离心10min，去上清，PBS洗涤2遍，溶解于PBS中；SAA捕获抗体使用超滤离心管洗涤3遍，洗涤液为PH7-8的0.05mol/LPB缓冲液；将洗涤后的捕获抗体与荧光微球混合偶联，控制抗体与荧光微球重量比是1/10-1/20，补充适量的PB缓冲液使PH等于7.2±0.2，混匀；室温反应1-4小时；离心去上清；加入封闭液封闭，封闭液含有0.1-1％卡泽35、10-50mmol/ml甘氨酸，反应2小时；使用荧光微球稀释液稀释到30-120倍，荧光微球稀释液配方：PBS+20％海藻糖或者蔗糖+1-3％吐温20；捕获抗体-荧光微球混合液以3.0-8.0ul/cm的浓度定量喷涂到玻璃纤维膜；25-60℃烘干1-4小时，干燥保存。样品垫为空白玻璃纤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测血清淀粉样蛋白A的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括，硝酸纤维素膜包被检测线与质控线，所述检测线使用血清淀粉样蛋白A检测抗体，所述质控线使用抗血清淀粉样蛋白A捕获抗体的二抗；制备结合垫，其包括：含有纳米增强型时间分辨荧光微球的PBS中，加入终浓度为10mg/ml的EDC与NHS，离心，沉淀经PBS洗涤后溶解于PBS中；血清淀粉样蛋白A捕获抗体使用抗体洗涤液离心洗涤；将洗涤后的血清淀粉样蛋白A捕获抗体与溶解有所述荧光微球的PBS混合，以使血清淀粉样蛋白A捕获抗体与荧光微球偶联；将偶联后的混合液喷涂到载体；其中，PBS为PH6‑7、浓度0.05mol/L。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测血清淀粉样蛋白A的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括，硝酸纤维素膜包被检测线与质控线，所述检测线使用血清淀粉样蛋白A检测抗体，所述质控线使用抗血清淀粉样蛋白A捕获抗体的二抗；制备结合垫，其包括：含有纳米增强型时间分辨荧光微球的PBS中，加入终浓度为10mg/ml的EDC与NHS，离心，沉淀经PBS洗涤后溶解于PBS中；血清淀粉样蛋白A捕获抗体使用抗体洗涤液离心洗涤；将洗涤后的血清淀粉样蛋白A捕获抗体与溶解有所述荧光微球的PBS混合，以使血清淀粉样蛋白A捕获抗体与荧光微球偶联；将偶联后的混合液喷涂到载体；其中，PBS为PH6-7、浓度0.05mol/L。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述荧光微球直径为100nm-300nm。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血清淀粉样蛋白A捕获抗体与荧光微球混合的重量比是1/10-1/20。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，血清淀粉样蛋白A捕获...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳佳，邵伟，王丽君，
申请(专利权)人：苏州遵道生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32