细胞群中的稀有细胞判读方法技术

本发明专利技术涉及生物统计分析领域，具体而言，涉及一种细胞群中的稀有细胞判读方法，所述方法通过检测细胞系某靶点的不同表达水平，计算细胞比值R(R为细胞的阳性信号值F/细胞的阴性信号值F')，用ROC曲线分析阳性细胞组比值和阴性组细胞比值，得到比值阈值Rt。同时计算荧光阈值

Methods for identifying rare cells in cell populations

The present invention relates to the field of bio-statistical analysis, in particular to a method of rare cell interpretation in a cell population. The method calculates the cell ratio R (R is the positive signal value F/cell negative signal value F') by detecting the different expression levels of a target in a cell line, and analyzes the positive cell group ratio and the ROC curve. The ratio of cells in negative group was Rt. Simultaneous calculation of fluorescence threshold

【技术实现步骤摘要】
细胞群中的稀有细胞判读方法
本专利技术涉及生物统计分析领域，具体而言，涉及一种细胞群中的稀有细胞判读方法。
技术介绍
细胞群中的稀有细胞判读是生物学或医学领域常见目的；其中常见应用例如从血液细胞中寻找循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell,CTC)。循环肿瘤细胞是肿瘤原发灶组织部位脱落进入血液循环的肿瘤细胞，大量实验证实CTC的检测有助于肿瘤复发转移的监控、患者预后的判断及患者术后治疗的指导[1,2]。CTCs的检测分析方法较多，常见的技术包括流式细胞分析、基因芯片、反转录-聚合酶链反应、免疫荧光技术等[3]。目前，CTCs免疫荧光检测已上市产品主要有强生公司的Cellsearch检测系统、武汉友芝友医疗科技股份有限公司的CTC-Biopsy检测系统等。Cellsearch检测系统对于肿瘤细胞的判定标准一般为：1)具有典型细胞形态，2)具有细胞核形态，3)细胞形态有区别于白细胞形态，4)CK染色为阳性，5)CD45染色为阴性，6)形态比例大于4×4μm，7)CK染色较背景色至少3倍以上，8)细胞膜CK染色区域至少50％以上，9)细胞膜CK染色较均匀，而非点状染色[4]。该分析系统虽然已经引入了计算机分析方法，经计算机辅助可以快速对肿瘤细胞进行判定，但仍然需要分析者对结果进行复核，而给出的判定指标并没有用数字进行量化，仍然很大程度上依赖分析者的主观印象，且基于简单的计算机辅助容易造成信息的丢失，导致结果误判。也有研究基于cellsearch检测系统，制定HER2阳性细胞的判读方法，该判读方法用相对比值(细胞HER2染色荧光值/细胞面积)/(背景荧光强度值/细胞面积)[5]。该方法虽然用相对简单的数值直接对HER2阳性细胞进行了定义，但该方法容易受背景染色影响，且结果容易出现假阳性。CTC-Biopsy检测系统是基于细胞的病理状态来进行CTC的判定，该系统虽然收集总结了目前大量细胞病理专家提出的CTC细胞形态标准，同时也与全国多家三甲医院的细胞病理专家一起进行了大量的免疫组化验证工作，但该系统对于分析者的要求苛刻，要求分析者必须是经过严格训练且具有一定水平的病理知识才能完成结果的判读，在实际操作中，对于同一份结果往往需要参考至少两位分析者严格的分析结果，这对于临床检验是不小的挑战[6]。正如目前临床上作为金标准的免疫组化，其判读方法也是基于大量细胞病理知识建立，但在临床上，其对于判读者的要求极其苛刻，且不同分析者对于同一份结果的判读存在一定的差异。因此，建立简单、快捷、准确的免疫荧光阳性细胞判读方法极为重要。参考文献[1]ECrowley,NFDi,FLoupakis,ABardelli.(2013)Liquidbiopsy:monitoringcancer-geneticsintheblood.NatureReviewsClinicalOncology10(8):472.[2]GBrock,ECastellanos-Rizaldos,LHu,etal.(2015)Liquidbiopsyforcancerscreening,patientstratificationandmonitoring.TranslationalCancerResearch4(3).[3]ZhangZ,RamnathNandNagrathS.(2015)CurrentstatusofCTCsasliquidbiopsyinlungcancerandfuturedirections.FrontOncol.5:209.[4]KCAndree,GVanDalum,LWMMTerstappen.(2016)Challengesincirculatingtumorcellsdetectionbythecellsearchsystem.MolecularOncology10(3):395-407.[5]IgnatiadisM,Rothe′F,ChaboteauxC,DurbecqV,RouasG,etal.(2011)HER2-PositiveCirculatingTumorCellsinBreastCancer.PLoSONE6(1):e15624.[6]李庞。(2015)改良ISET(CTC-Biopsy)技术体系的优化及其检测肿瘤患者循环肿瘤细胞效果的验证。济南大学，硕士学位论文。
技术实现思路
本专利技术涉及一种细胞群中的稀有细胞判读方法，包括以下步骤：将待检测的稀有细胞的标志物称之为X蛋白，细胞群的标志物称之为Y蛋白；使用第一信号强度指示剂标记抗X蛋白抗体，使用第二信号强度指示剂标记抗Y蛋白抗体；将X蛋白阳性细胞和阴性细胞分别添加到所述细胞群中，用所述抗X蛋白抗体和所述抗Y蛋白抗体分别检测X蛋白阳性细胞和阴性细胞，分别统计每张细胞图片的第一信号强度指示剂信号强度值F和第二信号强度指示剂信号强度值F'，并计算每张细胞图片的R＝F/F'；计算所有F的平均值和标准偏差s，得到荧光阈值当所述荧光阈值取95％置信区间时，n＝2；取99％置信区间时，n＝3；取99.9％置信区间时，n＝4；取99.99％的置信区间时，n＝5；用ROC曲线对各组R值进行分析，确定用于区分所述阳性细胞和所述阴性细胞的信号强度比值阈值Rt；对于所述细胞群的某细胞，若其F＞Ft，且R＞Rt，则其为具有X蛋白特征的稀有细胞。与现有技术相比，该方法简单、快捷、准确性高、一致性好。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例中HER2检测抗体和Herceptin抗体使用浓度确定；图2为本专利技术实施例中HER2检测抗体和Herceptin抗体检测细胞系HER2表达水平；Intensity指细胞FITC荧光值，代表HER2表达水平；Ratio指细胞图片的FITC荧光值比细胞图片的CY5荧光值；图3为本专利技术实施例中细胞染色与比值关系；BT474、SKBR3细胞为HER2高表达细胞系，FITC检测阳性，CY5检测阴性；A431、MDA-MB-231、MCF7为HER2低表达细胞系，FITC检测阴性，CY5检测阴性；WBC为HER2低表达、CD45表达细胞，FITC检测阴性，CY5检测阳性。图4为本专利技术实施例中不同细胞的比值分布；A：不同细胞比值分布，比值在3.0～5.0，HER2阳性细胞组(SKBR3、BT474)和HER2阴性细胞组(MCF7、A431、MDA-MB-231、WBC)存在较明显差异；B：比值分析HER2阳性细胞组(SKBR3、BT474)和HER2阴性细胞组(MCF7、A431、MDA-MB-231、WBC)；图5为本专利技术实施例不同比值阈值判读结果比较；A：3.5分析健康人、良性病变、乳腺癌样本，B：比值4.0分析健康人、良性病变、乳腺癌样本，C：比值4.5分析健康人、良性病变、乳腺癌样本；图6为本专利技术实施例不同判读方法对比；A：比值判读方法分析健康人、良性病变、乳腺癌样本；B：统计学判读方法分析健康人、良本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞群中的稀有细胞判读方法，其特征在于，包括以下步骤：将待检测的稀有细胞的标志物称之为X蛋白，细胞群的标志物称之为Y蛋白；使用第一信号强度指示剂标记抗X蛋白抗体，使用第二信号强度指示剂标记抗Y蛋白抗体；将X蛋白阳性细胞和阴性细胞分别添加到所述细胞群中，用所述抗X蛋白抗体和所述抗Y蛋白抗体分别检测X蛋白阳性细胞和阴性细胞，分别统计每张细胞图片的第一信号强度指示剂信号强度值F和第二信号强度指示剂信号强度值F'，并计算每张细胞图片的R＝F/F'；计算所有F的平均值

【技术特征摘要】
1.一种细胞群中的稀有细胞判读方法，其特征在于，包括以下步骤：将待检测的稀有细胞的标志物称之为X蛋白，细胞群的标志物称之为Y蛋白；使用第一信号强度指示剂标记抗X蛋白抗体，使用第二信号强度指示剂标记抗Y蛋白抗体；将X蛋白阳性细胞和阴性细胞分别添加到所述细胞群中，用所述抗X蛋白抗体和所述抗Y蛋白抗体分别检测X蛋白阳性细胞和阴性细胞，分别统计每张细胞图片的第一信号强度指示剂信号强度值F和第二信号强度指示剂信号强度值F'，并计算每张细胞图片的R＝F/F'；计算所有F的平均值和标准偏差s，得到荧光阈值当所述荧光阈值取95％置信区间时，n＝2；取99％置信区间时，n＝3；取99.9％置信区间时，n＝4；取99.99％的置信区间时，n＝5；用ROC曲线对各组R值进行分析，确定用于区分所述阳性细胞和所述阴性细胞的信号强度比值阈值Rt；对于所述细胞群的某细胞，若其F＞Ft，且R＞Rt，则其为具有X蛋白特征的稀有细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗X蛋白抗体为一种或多种；当所述抗X蛋白抗体为多种时，再将X蛋白阳性细胞和阴性细胞分别添加到细胞群中之前还包括：用抗X蛋白抗体Ab1、抗X蛋白抗体Ab2、抗X蛋白抗体Ab3……抗X蛋白抗体Abn和所述抗Y蛋白抗体分别检测X蛋白阳性细胞和阴性细胞，并分别计算所述第一信号强度指示剂信号强度值与所述第二信号强度指示剂信号强度值的比值R1、R2、R3……Rn。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一信号强度指示剂和第二信号强度指示剂选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、电子致密物质、胶体金或酶。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光物质包括Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa555、Alexa647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、CascadeBlue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、FITC(异硫氰酸荧光素)、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、PacificBlue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈林，唐东江，范献军，周燕玲，黄卫平，
申请(专利权)人：珠海丽珠圣美医疗诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44