一种用于测定D-3-羟基丁酸的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种测定D‑3‑羟基丁酸的试剂盒，所述试剂盒由pH=6.0的Tris缓冲液、作为探针分子的摩尔浓度为5×10‑3mol/L的2‑羟基‑1,3‑苯二甲醛双缩硫代氨基脲的DMSO溶液和摩尔浓度为1×10‑3mol/L的D‑3‑羟基丁酸溶液组成，本试剂盒可定量检测体外尿液或血清中D‑3‑羟基丁酸（D‑3‑HB）的含量，直接检测酮体含量最多且与并且含量正相关的D‑3‑羟基丁酸，能够克服酶法检测的缺点，实现灵敏准确检测D‑3‑羟基丁酸，有助于糖尿病早期诊断和治疗监控。

【技术实现步骤摘要】
一种用于测定D-3-羟基丁酸的试剂盒
本申请涉及生物化学和临床检验领域，具体地，涉及一种用于测定尿液或血清中D-3-羟基丁酸的试剂。
技术介绍
随着生活水平的提高，糖尿病也越来越普遍化和年轻化，给无数家庭带来灾难性的打击。然而相较于糖尿病本身，它的一些并发症比如糖尿病酮症酸中毒(DKA)，更容易威胁到人类的生命。引起DKA的酮体包括78%的D-3-羟基丁酸(D-3-hydoxybutyrateacid，D-HBA)、20%的乙酰乙酸（AcAc）丙酮、2%三种，主要成分是D-3-羟基丁酸。当乙酰乙酸和D-3羟基丁酸的含量超过血液中碳酸盐的缓冲能力时，就会导致酮中毒。由于糖尿病患者的糖利用率大大降低，而且，往往酮体含量的变化出现在作为糖尿病重要体征的血糖或者尿糖含量增高之前。同时，D-3-羟基丁酸的含量高且相对稳定，不受溶血、黄疸等的干扰，能够准确反映体内酮体水平。因此，美国糖尿病协会（ADA）早在1995年就建议将D-3羟基丁酸的检测作为DKA的可靠的指标，并且正常人体内D-羟丁酸浓度小于1mmol/L，高于3mmol/L就可以确定为酮症酸中毒。因此，酮体中D-3-HBA含量的测定对于预防糖尿病以及其并发症等有很重要的意义。目前临床上检测酮体浓度的方法最常用的是传统的硝普盐法。其基本工作原理是亚硝基铁氰化钠与酮体成分中含量较少的乙酰乙酸发生反应，络合生成一种紫红色化合物。酮体试纸法和酮体粉法都是基于这个原理建立起来的测试方法。这种方法操作简便，但临床是经常出现误诊漏诊现象。原因是硝普盐法是一种半定量法，准确度有限，其次是因其只对酮体中含量较少的乙酰乙酸有响应，而对含量最多的D-3羟基丁酸基本不发生反应。大量研究表明，病情越重的酮症酸中毒患者，其酮体中D-3羟基丁酸的比例越高，乙酰乙酸越少，此法诊断很容易造成漏诊。同时，亦有研究表明，恢复期的糖尿病患者体内，存在着大量的D-3羟基丁酸转化为乙酰乙酸，这样也给硝普盐法的诊断带来局限性。美国糖尿病协会（AmericanDiabetesAssociation即ADA）建议不再用硝普盐法测试尿液或者血液中酮体的浓度，可以定量检测D-3-羟基丁酸的浓度诊断DKA。此外，还有其他检测酮体的方法，比如比色法、分光光度法、电化学传感器方法等。但这三种方法或多或少存在一些不足，比色法是一种半定量的方法，准确度和精密度较低，分光光度法和电化学传感法需要依赖D-3-羟基丁酸脱氢酶的活性。鉴于上述需求，本领域仍然需要一种灵敏度高、准确度高的D-3-羟基丁酸检测试剂。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种测定D-3-羟基丁酸的试剂盒，以达到提高检测灵敏度和准确度的目的。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案：本专利技术一方面提供了一种测定D-3-羟基丁酸的试剂盒，所述试剂盒由pH=6.0的Tris缓冲液、作为探针分子的摩尔浓度为5×10-3mol/L的2-羟基-1,3-苯二甲醛双缩硫代氨基脲的DMSO溶液和摩尔浓度为1×10-3mol/L的D-3-羟基丁酸溶液组成，所述探针分子的结构式为：。进一步地，所述探针溶液和D-3-羟基丁酸溶液的摩尔比为1:4~50:1。进一步地，所述2-羟基-1,3-苯二甲醛双缩硫代氨基脲探针分子的合成步骤为：将摩尔比1：2的2-羟基-5-甲基-1,3-苯二甲醛和硫代氨基脲溶于无水乙醇中，加热溶解，回流反应4～6h，TLC跟踪反应至终点，停止反应，冷却、抽滤得到黄色粉末，重结晶、干燥，即得2-羟基-1,3-苯二甲醛双缩硫代氨基脲。本专利技术另一方面提供了所述的试剂盒在测试尿液或血清中D-3-羟基丁酸含量的应用。本专利技术的有益效果在于:本专利技术利用荧光探针技术，且本试剂盒可定量检测体外尿液/血清中D-3-羟基丁酸（D-3-HB）的含量，直接检测酮体含量最多且与并且含量正相关的D-3-羟基丁酸，能够克服酶法检测的缺点，实现灵敏准确检测D-3-羟基丁酸，准确测定人尿液/血清中D-3-羟基丁酸将有助于糖尿病早期诊断和治疗监控，能够克服酶法检测的缺点，实现灵敏准确检测D-3-羟基丁酸。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。本专利技术一种典型的实施方式提供了一种测定D-3-羟基丁酸的试剂盒，所述试剂盒由pH=6.0的Tris缓冲液、作为探针分子的摩尔浓度为5×10-3mol/L的2-羟基-1,3-苯二甲醛双缩硫代氨基脲的DMSO溶液和摩尔浓度为1×10-3mol/L的D-3-羟基丁酸溶液组成，所述探针分子的结构式为：。本专利技术克服了现有检测方法由于酶活性以及酶的保存问题而限制其应用，利用荧光探针技术，直接检测酮体含量最多且与含量正相关的D-3-羟基丁酸。样品中的D-3-羟基丁酸，会与试剂盒中的探针分子结合，快速生成一种稳定的复合物，引起体系的紫外光区在500nm处有最大吸收峰，或者在562nm处有荧光强度逐渐增强，其紫外吸收值/荧光强度与D-3-羟基丁酸的浓度呈正相关，根据强度的变化计算样品中的D-3-羟基丁酸的含量。在上述优选地实施方式中，所述探针溶液和D-3-羟基丁酸溶液的摩尔比为1:4~50:1。在上述优选地实施方式中，所述2-羟基-1,3-苯二甲醛双缩硫代氨基脲探针分子的合成步骤为：将摩尔比1：2的2-羟基-5-甲基-1,3-苯二甲醛和硫代氨基脲溶于无水乙醇中，加热溶解，回流反应4～6h，TLC跟踪反应至终点，停止反应，冷却、抽滤得到黄色粉末，重结晶、干燥，即得2-羟基-1,3-苯二甲醛双缩硫代氨基脲。本专利技术另一种典型的实施方式提供了上述试剂盒在测试尿液/血清中D-3-羟基丁酸含量的应用。下面结合实施例对本专利技术技术方案及其有益效果做进一步的说明:实施例12-羟基-1,3-苯二甲醛双缩硫代氨基脲探针分子的合成：称取0.73g(5mmol)2-羟基-5-甲基-1,3-苯二甲醛于20mL的无水乙醇中，加热使其溶解，再加入0.91g(10mmol)硫代氨基脲，将得到的反应液加热回流反应5小时，TLC跟踪反应至终点，停止反应，冷却静置至室温，抽滤，得到黄色粉末。黄色粉末用无水乙醇和水的混合溶剂重结晶，干燥，得淡黄色固体，抽滤得化合物T。产品经无水乙醇、无水乙醚各洗涤三次后真空干燥，得到纯品，产率分别为78%。固体粉末用甲醇重结晶，一周后析出黄色块状单晶。样品收集和贮存样品可为人尿液/血清。若样品为人尿液，以新鲜中段晨尿为宜，尿液2-8℃保存3-4天；若样品为人血清，以空腹血清为宜，避免溶血和脂血，血清在2-8℃可稳定7天左右。参数设置使用紫外分光光度计或者荧光光度计测试时，参数设置如表1所示：测定步骤利用紫外可见光谱进行测试时，溶液配置如表2：利用荧光光谱进行测试时，溶液配置如表3：尿样稀释10倍，血样稀释100倍；上述试剂在2～8℃避光条件下贮存（勿冷冻）可稳定至失效期；若试剂空白>0.5则视为失效。结果计算紫外可见光谱进行测试：样品中D-3-HB浓度（mmol·L-1）=[（ΔAU-ΔAB）/（ΔAS-ΔAB）]×CS式中：ΔAU样品管的吸收度变化ΔAB校准管的吸收度变化ΔAs空白管的吸收度变化CS校本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定D‑3‑羟基丁酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由pH = 6.0的Tris缓冲液、作为探针分子的摩尔浓度为5×10‑3mol/L的2‑羟基‑1,3‑苯二甲醛双缩硫代氨基脲的DMSO溶液和摩尔浓度为1×10‑3mol/L的D‑3‑羟基丁酸溶液组成，所述探针分子的结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种测定D-3-羟基丁酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由pH=6.0的Tris缓冲液、作为探针分子的摩尔浓度为5×10-3mol/L的2-羟基-1,3-苯二甲醛双缩硫代氨基脲的DMSO溶液和摩尔浓度为1×10-3mol/L的D-3-羟基丁酸溶液组成，所述探针分子的结构式为：。2.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针溶液和D-3-羟基丁酸溶液的摩尔比为1:4~50:1。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王清明，孙慧芳，徐梦怡，王年华，王文玲，胡天祥，
申请(专利权)人：盐城师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32