【技术实现步骤摘要】
一种食源性致病菌现场快速检测方法
本专利技术涉及食源性致病菌检测
，具体涉及一种基于Aptamer/上转换荧光纳米探针实现荧光共振能量转移的现场快速、高灵敏度和高特异性的食源性致病菌检测方法。
技术介绍
近年来，由于食源性致病菌引起的食物中毒事件不断发生，这给人们的健康生活造成极大影响，同时造成巨大的经济损失，由病原微生物引起的食品安全问题已被世界各国广泛关注。细菌性食物中毒常致病菌主要有副溶血性弧菌、沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、致泻性大肠埃希菌等。因此，建立一种现场快速、准确、便捷、灵敏度高、特异性强的食源性致病菌检测技术，是确保食品安全的有效方法和关键技术。食源性致病菌的传统检测方法主要有微生物培养法、电阻电导测定法、细菌直接计数法、分子生物学法、免疫学方法、液相色谱法、气质联用法等。但是传统微生物检测方法，不仅样品前处理复杂，而且耗时费力、成本过高、特异性和灵敏度均不高，只能作为疑似样品的确证方法，无法满足食品安全督查现场检测的需求。近年来，现代生物技术在微生物检测领域也得到了广泛应用，如DNA探针、聚合酶链式反应、生物芯片等方法...
【技术保护点】
1.一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：步骤一、筛选得到常见食源性致病菌适配体，测定适配体与靶标的特异性和亲和力，拟合解离常数曲线；并合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链；步骤二、利用高温共沉淀法，获得AReF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒；步骤三、利用配体交换法在UCNPs表面修饰氨基，获得氨基修饰的UCNPs，使用无水乙醇和去离子水洗涤2‑4次；步骤四、利用EDC/Sulfo‑NHS作为偶联剂，先活化致病菌适配体的羧基端30‑60 min，再加入适量氨基修饰的UCNPs，室温搅拌16‑24 h；离心、洗涤得到Aptamer‑UCNPs纳米探针；采用相同的方法将...
【技术特征摘要】
1.一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：步骤一、筛选得到常见食源性致病菌适配体，测定适配体与靶标的特异性和亲和力，拟合解离常数曲线；并合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链；步骤二、利用高温共沉淀法，获得AReF4:Yb,Er上转换荧光纳米微粒；步骤三、利用配体交换法在UCNPs表面修饰氨基，获得氨基修饰的UCNPs，使用无水乙醇和去离子水洗涤2-4次；步骤四、利用EDC/Sulfo-NHS作为偶联剂，先活化致病菌适配体的羧基端30-60min，再加入适量氨基修饰的UCNPs，室温搅拌16-24h；离心、洗涤得到Aptamer-UCNPs纳米探针；采用相同的方法将与适配体对应的互补寡核苷酸单链与AF546荧光染料进行共价偶联得到AF546-cDNA；步骤五、将一定量Aptamer-UCNPs纳米探针和AF546-cDNA加入到1-3mL杂交缓冲液中，室温搅拌20-60min，通过碱基互补配对获得AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物；使用980nm便携式半导体激光器激发纳米复合物溶液，利用普通数码相机拍照记录纳米复合物荧光发光图片；利用荧光光谱仪测定纳米复合物荧光光谱，分别积分计算510-560nm、640-680nm波段的荧光强度G510-560和R640-680，得到两个波段的荧光强度比值GRR=G510-560/R640-680。2.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：所述步骤一，利用whole-bacteriaSELEX技术筛选得到常见食源性致病菌适配体。3.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：所述步骤二高温共沉淀法，将1.0mmolReCl3·6H2O加入到按一定比例混合的油酸、十八烯反应体系中，反应体系抽真空并加热至140-160℃保温40-90min；反应体系冷却至25-50℃，加入溶解于甲醇中的NH4F、AOH(A：Li/Na)溶液，室温搅拌反应30-120min；反应体系加热至80-120℃，通大气流量的惰性气体（Ar、N2）排甲醇20-40mi...
【专利技术属性】
技术研发人员：俞樟森，钱沁清，张建华，孙爱静，张衡，方剑，张小娟，
申请(专利权)人：绍兴文理学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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