The present invention provides a genome editing method for Corynebacterium glutamicum, which includes two aspects of gene knockout and multi-copy integration: 1. When knocking out some genes affecting growth, the pk18mobsacB plasmid is used for the first round of homologous recombination, and then the CRISPR/Cpf1 double-stranded cleavage of the genome is used as the screening pressure to select the positive gene. The second homologous recombination did occur, which ensured the efficiency of the correct knockout strain. 2. In the process of gene multi-copy integration, pk18mobsacB was inserted into the Cpf1 site of the genome during the first round of homologous recombination by special homologous sequence design principle, thus destroying the PAM structure and causing CRISPR/Cpf1 not to occur in the genome. Biocleavage ensures the specific integration of the target gene. When integrated into an already copied sequence or other site, crRNA can identify the designed cleavage sequence and lead to double-stranded cleavage of Cpf1, resulting in the inability of the strain to survive.
【技术实现步骤摘要】
一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法
本专利技术涉及基因工程
，尤其是一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法。
技术介绍
在微生物工业化生产中，希望得到尽可能高产量的产品。一种提高产量的方法是提高编码目的蛋白的基因的拷贝数量。这可以由将基因放于高拷贝数量质粒达到，但是如果在宿主细胞培养过程中没有选择性压力质粒是不稳定的且经常从宿主细胞中丢失。另一种提高目的基因拷贝数量的方法是将其以多拷贝整合入宿主基因组。同时，利用代谢工程构建生产菌株时，往往需要将一些副产物合成途径的基因敲除掉以加强目标产品合成的代谢流。总之，在基因组水平进行基因敲除和多拷贝关键基因的整合已经成为微生物分子育种的常规手段。谷氨酸棒杆菌为为GRAS生物安全菌，在氨基酸发酵领域有着举足轻重的地位，至今已经被安全应用了近60年。目前，包括谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等大多数氨基酸都是利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产。近年来，随着基因工程手段引入谷氨酸棒杆菌菌种选育，构建出许多工程化谷氨酸棒杆菌菌株，其可利用的底物谱已得到极大的扩展，同时也可以生产出有机酸、醇类、二胺、萜类等化合物。目前，...
【技术保护点】
1.一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，其特征在于：谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除aroE进行构建，具体步骤如下：(1)敲除质粒构建：以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，△aroE‑1，△aroE‑2为引物，通过PCR反应扩增427bp的敲除aroE的上游同源臂；以△aroE‑3，△aroE‑4为引物，通过PCR反应扩增559bp的下游同源臂；以△aroE‑1，△aroE‑4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成1545bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl...
【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，其特征在于：谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除aroE进行构建，具体步骤如下：(1)敲除质粒构建：以CorynebacteriumglutamicumATCC13032基因组为模板，△aroE-1，△aroE-2为引物，通过PCR反应扩增427bp的敲除aroE的上游同源臂；以△aroE-3，△aroE-4为引物，通过PCR反应扩增559bp的下游同源臂；以△aroE-1，△aroE-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成1545bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化后与重叠片段同源重组，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△aroE；(2)切割质粒构建：通过CHOPCHOP设计aroE切割序列，从而设计切割所需crRNA序列：首先将质粒pXMJ19中的氯霉素抗性基因换成奇霉素抗性基因；然后用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19，纯化后与cpf1同源重组；提取质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI酶切，纯化后与crRNA同源重组，最终得到aroE切割质粒pXMJ19Cmr∷sper-cpf1-crRNA-△aroE；(3)敲除aroE目的菌株的获得：将CorynebacteriumglutamicumATCC13032制成感受态细胞，将非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△aroE电转化到13032感受态细胞中，通过一次同源重组使非复制型质粒结合到谷氨酸棒杆菌基因组中，挑在卡那霉素抗性平板能正常生长的单菌落，以特异性鉴定引物△aroE-5，△aroE-6，△aroE-7，△aroE-8进行菌落PCR，条带大小正确的菌，接种于带有卡那霉素抗性的摇管里培养，得到13032△aroE单交换菌，将这个菌也制作成感受态，然后将切割质粒pXMJ19Cmr∷spercpf1crRNA-△aroE电转化到感受态细胞中，涂布于奇霉素抗性和链霉素抗性的平板，长出单菌落后以△aroE-1，△aroE-4为引物进行菌落PCR验证，条...
【专利技术属性】
技术研发人员：李燕军，徐庆阳，张成林，韩超，张德志，蔡柠匀，谢希贤，陈宁，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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