KPNA7基因片段作为猪繁殖性状相关的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术属于猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及KPNA7基因片段作为猪繁殖性状相关的分子标记及应用。所述的分子标记与猪繁殖性状如产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度、木乃伊个数性状关联。所述的分子标记是从影响猪卵母细胞发育的基因KPNA7中克隆得到，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的47bp处存在一个C/T突变，该突变导致Hpy166II‑RFLP多态性。本发明专利技术还公开了该分子标记在猪繁殖性状特别是产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状关联中的应用。

【技术实现步骤摘要】
KPNA7基因片段作为猪繁殖性状相关的分子标记及应用
本专利技术属于猪的分子标记筛选
，具体涉及KPNA7基因作为猪繁殖性状相关的分子标记及应用，所述的猪繁殖性状包括猪产活仔数(NBA)、有效活仔数(ENBA)、仔猪初生重均匀度(CV)、木乃伊个数(Mummy)等性状。所述的分子标记从猪KPNA7基因中克隆得到，它包括猪KPNA7基因第6外显子序列中突变位点的检测及其应用。
技术介绍
在养猪业中，产活仔数、有效活仔数等是重要的经济性状，这些性状属于低遗传力性状(Schneideretal2012)，利用传统育种手段对这些繁殖性状进行改良耗时长、进程缓慢。在现代育种工作中，分子育种成为有效改良繁殖性状的新途径，因此猪繁殖性状相关调控基因或标记的鉴定能够为运用分子育种技术改良猪繁殖性状奠定基础。国内外研究者发现，中国太湖流域猪种的高产仔性能与其高排卵能力相关，排卵数是决定产仔数的第一要素(张照1991；Terguietal1992)。后又有研究发现黄体数与天津白猪、长白猪的妊娠30天胚胎数、产仔数之间成正相关(周双海等2001)。Foxcroft等(2006)认为排卵数多除了可以提高产仔数，可能还会因为子宫容受性紧张带来负面结果，如降低胎儿成活率、影响胎儿体重和胴体品质等。因此，猪卵母细胞的发育、成熟可能影响排卵数，从而影响产仔数等有关繁殖性状。Guo等(2016)利用全基因组关联分析手段发现KPNA7基因的第6内含子和第8内含子位于与猪产仔数、5天活仔数性状相关的QTL区域内。KPNA7基因属于核转运蛋白家族(Kayopherin)，主要介导大分子物质在细胞核内外的转运，参与基因表达、细胞分裂、细胞凋亡、细胞极性建立等重要生物学过程(樊静和朱运松2003)。研究发现KPNA7在牛卵母细胞中表达，敲除KPNA7基因，导致早期胚胎发育异常(Tejomurtulaetal2009)。在小鼠中，KPNA7基因在小鼠卵母细胞中表达，突变该基因后，发现在妊娠8.5天后部分胚胎死亡，小鼠繁殖力降低(Huetal2010)。近来有研究发现KPNA7基因在猪的GV、MⅡ卵母细胞、2-cell胚胎和4-cell胚胎中表达，可能调控猪卵母细胞成熟和胚胎早期分裂(XinWangetal2012)。鉴于以上研究结果，申请人认为KPNA7基因可能在猪卵母细胞发育、成熟及早期胚胎发育过程中发挥重要作用，从而影响母猪的繁殖性状。对基因突变的多态性位点在群体中进行关联分析是研究基因功能的一个有力方法，所以申请人对KPNA7基因进行了多态性关联分析，以期为猪的繁殖性状提供新的分子标记。
技术实现思路
专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，利用KPNA7基因片段作为猪繁殖性状相关的分子标记及应用。本专利技术涉及的猪的繁殖性状主要包括产活仔数(NBA)、有效活仔数(ENBA)、仔猪初生重均匀度(CV)和木乃伊个数(Mummy)等性状。本专利技术的分子标记从KPNA7基因第6外显子中克隆得到，通过建立突变位点的多态性检测方法，为母猪产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数等性状检测提供关联标记。本专利技术的技术方案如下：申请人筛选得到一种与猪繁殖性状尤其是与产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状相关的分子标记，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：TTGTTGCCTAGCTCGGTGAGCTCATTTAAAGACACTCACTGGTACAY(C/T)TTGAGGAAGCCAGGGCCAGCAGATGTGGGATGGCATTGCTGGAGATAACGATGTCTCTGAATTCTGCGCCATCACCTACAAATAGGGGAGAACATGACACTCAAAGAGGGAACACAGGGAACCCGGGGTGGGTGACGAATTCTT，上述序列中47位的Y是C或T，该突变导致Hpy166II-RFLP多态性。申请人设计了一种检测上述分子标记的引物对，该分子标记的引物对的DNA序列如下所示：正向引物：TTGTTGCCTAGCTCGGTGAG，反向引物：AAGAATTCGTCACCCACCCC。申请人提供了一种与猪繁殖性状尤其是与产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状相关的分子标记(即KPNA7基因外显子6)的筛选方法和PCR-Hpy166II-RFLP在猪产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度、木乃伊个数性状中的关联分析应用方法，所述方法的具体步骤如下所述：(1)通过在Ensemble(见：http://www.ensembl.org/Sus_scrofa/Gene/Summary)数据库中查阅，申请人在KPNA7基因的第6外显子中找到一个候选的SNP(编号为rs326578619,Sscrofa10.2)；(2)根据NCBI数据库(Sscrofa10.2)中猪KPNA7基因的基因组序列(GeneBankAccession:NC_010445.4)设计引物对突变位点进行克隆，其中正向引物为：5’-TTGTTGCCTAGCTCGGTGAG-3’，反向引物为：5’-AAGAATTCGTCACCCACCCC-3’(SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)，然后从大白猪母猪耳组织样品中提取基因组DNA作为模板，克隆得到KPNA7基因部分DNA序列，序列如下所示(长度为191bp，序列表SEQIDNO：1的序列如下，但第47位的序列是突变后即替换的序列)：TTGTTGCCTAGCTCGGTGAGCTCATTTAAAGACACTCACTGGTACAYTTGAGGAAGCCAGGGCCAGCAGATGTGGGATGGCATTGCTGGAGATAACGATGTCTCTGAATTCTGCGCCATCACCTACAAATAGGGGAGAACATGACACTCAAAGAGGGAACACAGGGAACCCGGGGTGGGTGACGAATTCTT，上述序列中的Y是T或C，该突变导致Hpy166II-RFLP多态性；其中：上述序列中第1-20序列是扩增该片段的正向引物，第172-191位序列是扩增该片段的反向引物序列(上述引物序列同时也是检测本专利技术筛选的分子标记多态性的引物序列)；(3)应用PCR-RFLP方法对上述序列的第47位碱基进行检测：其中，SNP检测方法为：在扩增得到的191bp片段上，存在一个Hpy166II酶切位点，PCR产物经酶切后电泳检测，测序检测结果显示在KPNA7基因的该C/T位点存在3种基因型(如图3所示)：即：CC(44bp、147bp)基因型，CT基因型(191bp、147bp、44bp)，TT基因型(191bp)。酶切电泳结果证实KPNA7基因第6外显子内该突变位点存在。(4)该突变位点(rs326578619)在母猪繁殖性状中的应用尚不明确，因此，本专利技术将位点基因型与母猪繁殖性状进行关联分析。本专利技术的分子标记可在猪繁殖性状尤其是产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状标记辅助选择中应用。本专利技术的引物对可在猪繁殖性状尤其是产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状标记辅助选择中应用。更详细的技术方案和效果如《具体实施方式》所示。附图说明序列表SEQIDNO:1是本专利技术筛选的分子标记的核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.位于KPNA7基因外显子6的一种分子标记的Hpy166II‑RFLP在母猪产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状关联分析中的应用，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，在SEQ ID NO:1所述序列的47位有一个C或T的等位基因突变，该突变导致Hpy166II‑RFLP多态性。

【技术特征摘要】
1.位于KPNA7基因外显子6的一种分子标记的Hpy166II-RFLP在母猪产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状关联分析中的应用，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO:1所述，在SEQIDNO:1所述序列的47位有一个C或T的等位基因突变，该突变导致Hpy166II-RFLP多态性。2.一种检测SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：余梅，侯苏梅，肖玉净，郭猛，李新云，刘向东，李小平，赵书红，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42