一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法，包括以下步骤：（1）健康悬浮sf9昆虫细胞作为转染受体细胞，铺设6孔板；（2）采用无内毒素质粒提取试剂盒，提取重组转移载体质粒；（3）采用qBac‑IIIG杆粒和重转移载体P1064质粒体系进行重组杆状病毒拯救载体；（4）采用Sinofection转染试剂辅助将qBac‑IIIG杆粒和重组转移载体P1064转入健康悬浮sf9昆虫细胞中，获得重组杆状病毒。本发明专利技术利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒方法的建立，具有以下有益效果：可利用悬浮SF9昆虫细胞进行转染，转染效率高，通过荧光显微镜早期可以直接判断转染是否成功及转染效率，为疫苗行业高效获得重组杆状病毒表达疫苗抗原工作打下了工作基础。

【技术实现步骤摘要】
一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法
本专利技术涉及生物基因工程领域，具体说是一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法。
技术介绍
自利用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)在草地贪夜蛾Laphygmafrugiperda细胞Sf9中表达出人β-干扰素以来,作为当今基因工程四大表达系统之一的杆状病毒表达载体系统因其独特的优点和巨大发展潜力,日益受到各国学者重视。疫苗研究方面:由于昆虫杆状病毒表达系统表达的产物成本低、表达量高、构像接近天然蛋白等特点,在疫苗研制中显示了诱人前景。另外杆状病毒可以容载大片段外源基因而使多个基因共表达,这使其在疫苗研究中更具优势,被认为是表达病毒样颗粒(virus-likeparticle,VLP)的最佳表达系统。但不同昆虫杆状病毒表达体系中前期重组杆状病毒获得，均有以下缺点：1.无法评判转染效率，只能通过杆粒转染后4-6天后细胞出现明显病变后判定转染是否成功重组杆状病毒；2.转染细胞受体基本全部采用贴壁sf9昆虫细胞，贴壁sf9昆虫细胞生长缓慢，培养周期长；3.因sf9细胞本身特性，转染效率较低，导致F0代重组杆状病毒含量少，F1扩大培养病毒滴度低，需要进行再次扩大培养；4.因杆粒及转移载体质粒无法保证严格无菌以及转染操作因素，经常细胞污染导致转染失败；5.因提取质粒带有细菌内毒素原因，引发sf9细胞死亡，导致转染失败。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法，本专利技术的目的之一是提供一种sf9悬浮昆虫细胞高效率转染的方法；本专利技术的目的之二是提供一种可以判断转染效率的昆虫细胞转染体系；本专利技术的目的之三是提供一种有效降低因细胞污染等因素导致的转染失败的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：为实现上述专利技术目的之一，本专利技术是通过以下技术方案实现的：1.复活含有转移载体的菌液，提取重组转移载体质粒，严格按无内毒素质粒提取试剂盒说明书进行，最后用无菌水(ph8.0)洗脱，EP管灭菌；2.准备昆虫细胞sf9，健康悬浮sf9昆虫细胞传代培养至24h，利用悬浮昆虫细胞无血清培养基VIGOR-S100将细胞密度稀释至1×106cell/ml，6孔板每孔加入1ml细胞，静置培养3h；3.1μlqBac-IIIG杆粒和3μl重组转移载体P1064混匀后，用无菌生理盐水稀释至100μl，3.5μlSinofection转染试剂用无菌生理盐水稀释至100μl，静置10min。4.将上述杆粒与重组转移载体混合物逐滴加入Sinofection转染试剂生理盐水溶液中，静置20min后；5.用无菌生理盐水补齐600μl，加入到PBS清洗一次的6孔板sf9细胞孔中，26℃孵育2h；6.吸去孵育混合物，加入2ml加青链霉素（青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml）的悬浮昆虫细胞无血清培养基VIGOR-S10026度静置培养。为实现上述专利技术目的之二，本专利技术是通过以下技术方案实现的：1.我们采用带GFP标记qBac-IIIG杆粒和转移载体P1064体系进行重组病毒拯救。2.转染后24h、48h通过荧光显微镜观察sf9细胞是否出现荧光现象，以判断是否转染成功。3.转染后120-144h收集细胞培养上清，按0.1-1%接种比例进行重组杆状病毒传代，接种sf9悬浮昆虫细胞，细胞密度（2-4×106cell/ml）传代后96h收集接毒上清液，测定F1病毒TCID50。为实现上述专利技术目的之三，本专利技术是通过以下技术方案实现的：1.悬浮sf9昆虫细胞铺设在6孔板中间两孔，左右四孔用加入青链霉素（青霉素1000U/ml、链霉素1mg/ml）和两性霉素B（0.25μg/ml）的2mlPBS铺板；2.孵育完毕后，吸去孵育混合物，加入2ml加青链霉素（青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml）的悬浮昆虫细胞无血清培养基VIGOR-S100。3.复活含有转移载体的菌液，提取重组转移载体质粒，严格按无内毒素质粒提取试剂盒说明书进行，最后用无菌水(pH8.0)洗脱，EP管灭菌。由于采用了上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术可以提高sf9悬浮昆虫细胞转染效率，F0代重组杆状病毒按0.1%稀释比例进行传代，F1代重组杆状病毒病毒滴度可以达到8.5以上，最高可以达到9.25。按0.1%稀释比例进行传代，F1代重组杆状病毒可以扩大到2L，F2代可以扩大到2000L，大大缩短了生产周期，节约了生产时间成本；2.本专利技术可以通过荧光显微镜提前判断sf9悬浮昆虫细胞转染是否成功，转染后48h即可判定转染是否成功，最早24h就可以做出判断，而常规方法需要96-120h左右才可以做出初步判断，是否转染成功需要做间接免疫荧光或western-blot实验进一步判断；3.本专利技术可以提高sf9悬浮昆虫细胞转染成功率，降低因操作原因、重组转移载体质粒带菌、质粒提取未去除内毒素造成的转染失败几率，本专利技术利用三种不同重组转移载体进行10次测试，成功率达到100%；综上所述，本专利技术利用悬浮SF9昆虫细胞进行转染，转染效率高，通过荧光显微镜早期可以直接判断转染是否成功及转染效率，为疫苗行业高效获得重组杆状病毒表达疫苗抗原工作打下了工作基础。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步地说明。附图说明：图1为实施例1中sf9细胞转染后效果图。图2为实施例2中sf9细胞转染后效果图。图3为实施例3中sf9细胞转染后效果图。实施例1：猪圆环2型CAP基因重组杆状病毒获得1.准备重组转移载体质粒：取一支携带重组转移载体质粒的菌液（命名为P1064-PCV-CAP2），按1:100倍稀释接菌，活化12h后，提取质粒，严格按无内毒素质粒提取试剂盒说明书进行，最后用无菌水(pH8.0)洗脱，EP管灭菌；2.准备转染用昆虫细胞：将健康悬浮sf9昆虫细胞传代培养至24h，利用悬浮昆虫细胞无血清培养基VIGOR-S100将细胞密度稀释至1×106cell/ml，6孔板每孔加入1ml细胞，静置培养3h；悬浮sf9昆虫细胞铺设在6孔板中间两孔，左右四孔用加入青链霉素（青霉素1000U/ml、链霉素1mg/ml）和两性霉素B（0.25μg/ml）的2mlPBS铺板。3.稀释杆粒、转移载体、转染试剂：1μlqBac-IIIG杆粒和3μlP1064-PCV-CAP2质粒混匀后，用无菌生理盐水稀释至100μl，3.5μlSinofection转染试剂用无菌生理盐水稀释至100μl，静置10min。4.混合杆粒复合物和转染试剂：将上述杆粒与重组转移载体混合物逐滴加入Sinofection转染试剂生理盐水溶液中，静置20min后；5.孵育：用无菌生理盐水将上述混合物补齐至600μl，PBS清洗一次6孔板中的sf9细胞，将600μl混合物缓慢加入到6孔板中的sf9细胞中，26℃孵育2h；6.吸去孵育混合物，加入2ml加青链霉素（青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml）的悬浮昆虫细胞无血清培养基VIGOR-S100，26℃静置培养；7.转染后24h、48h、72h通过荧光显微镜观察sf9细胞，转染后效果见图1；8.成功转染后144h收集细胞培养上清（F0代重组杆状病毒），重组病毒命本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）健康悬浮sf9昆虫细胞作为转染受体细胞，铺设6孔板；（2）采用无内毒素质粒提取试剂盒，提取重组转移载体质粒；（3）采用qBac‑IIIG杆粒和重组转移载体P1064体系进行重组杆状病毒拯救载体；（4）采用Sinofection转染试剂辅助将带有GFP标签的qBac‑IIIG杆粒和重组转移载体P1064转入健康悬浮sf9昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；（5）转染后荧光显微镜观察sf9细胞荧光出现情况；（6）收集转染后细胞培养上清，进行重组杆状病毒传代，测定F1病毒TCID50。

【技术特征摘要】
1.一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）健康悬浮sf9昆虫细胞作为转染受体细胞，铺设6孔板；（2）采用无内毒素质粒提取试剂盒，提取重组转移载体质粒；（3）采用qBac-IIIG杆粒和重组转移载体P1064体系进行重组杆状病毒拯救载体；（4）采用Sinofection转染试剂辅助将带有GFP标签的qBac-IIIG杆粒和重组转移载体P1064转入健康悬浮sf9昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；（5）转染后荧光显微镜观察sf9细胞荧光出现情况；（6）收集转染后细胞培养上清，进行重组杆状病毒传代，测定F1病毒TCID50。2.如权利要求1所述的一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，步骤（1）中健康悬浮sf9昆虫细胞传代培养至24h，利用悬浮昆虫细胞无血清培养基VIGOR-S100将细胞密度稀释至0.8-1×106cell/ml，6孔板每孔加入1ml细胞，静置培养3-5h。3.如权利要求1或2所述的一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，悬浮sf9昆虫细胞6孔板的铺设方法为：将悬浮sf9昆虫细胞铺设在6孔板中间两孔，左右四孔用加入青链霉素和两性霉素B的2mlPBS铺板。4.如权利要求1所述的一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，步骤（2）中复活含有转移载体的菌液，培养12h后提取重组转移载体质粒，严格按无内毒素质粒提取试剂盒说明书进行，最后用(pH8.0)无菌水洗脱，EP管灭菌。5.如权利要求1所述的一种利用sf9悬浮...

【专利技术属性】
技术研发人员：张恒，朱海燕，赵泽升，李朝阳，宋桂才，薛希娟，
申请(专利权)人：山东信得动物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37