表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒及应用制造技术

表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒及应用，其在猪源BVDV的C核衣壳蛋白基因N端插入了猪流行性腹泻病毒S基因的中和抗原表位序列。本发明专利技术获得一种重组感染性克隆质粒，该质粒线性化后，体外转录成RNA，并转染MDBK细胞，能成功拯救出表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的猪源BVDV重组病毒，该猪源BVDV重组病毒可表达PEDV S外源蛋白，同时用于PEDV和BVDV的防控。本发明专利技术的猪源BVDV重组感染性克隆为其他外源基因提供了合适的插入位点，可用作重组病毒载体，为后续体外修饰RNA、外源基因的插入、重组病毒的制备等研究提供有效的技术平台。

* * porcine BVDV recombinant virus expressing S gene of porcine epidemic diarrhea virus and its application

The porcine BVDV recombinant virus expressing porcine epidemic diarrhea virus S gene and its application were inserted into the N terminal of C nucleocapsid protein gene of pig BVDV and inserted into the neutralization epitope sequence of the S gene of porcine epidemic diarrhea virus. A recombinant infectious clone plasmid is obtained. After being linearized, the plasmid is transcribed into RNA in vitro and transfected into MDBK cells, and the pig derived BVDV recombinant virus expressing S protein of porcine epidemic diarrhea virus can be successfully rescued. The recombinant BVDV virus of the pig source can express PEDV S heterologous protein, and is used for the prevention and control of PEDV and BVDV. The recombinant infectious clone of pig origin BVDV provides suitable insertion sites for other foreign genes, and can be used as recombinant viral vectors, providing effective technical platform for subsequent studies on RNA modification, insertion of foreign genes, and preparation of recombinant viruses.

【技术实现步骤摘要】
表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒及应用
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒及其应用。
技术介绍
牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)和猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)同属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，在血清学上具有一定的交叉反应。BVDV除了感染牛，还可感染猪，它引发的临床症状影响或隐性感染可以影响到养猪业生产的各个环节，如生长迟缓、繁殖障碍、继发感染和持续感染等等。该病几乎在国内各个省市均有流行，邓宇等利用套式RT-PCR在2007～2010年对国内部分地区的临床样品进行筛查，检出BVDV的阳性率分别为23.1％(2007年)、27.7％(2008年)、33.6％(2009年)和23.6％(2010年)。猪感染BVDV不表现出临床症状，或出现类似于猪瘟的症状，因而不仅给猪瘟的预防和控制带来了很大的困难，也使BVDV的防控难上加难。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的以呕吐、腹泻、脱水和对哺乳仔猪致死率高为特征的一种高度接触性猪肠道传染病。S蛋白是PEDV编码蛋白中的一种结构蛋白，它能把病毒粒子吸附在宿主细胞受体上，通过膜融合渗进细胞中，刺激宿主诱导产生中和抗体，具有PEDV抗原的作用。PEDV的核心表位抗原存在于S蛋白的编码基因中，被认为是PEDV亚单位疫苗的重要靶标抗原。2011年，猪流行性腹泻在我国大规模流行，给养猪业造成严重的经济损失，PEDV毒株的变异，特别是S基因的变异，现有疫苗不能提供足够的免疫保护是引起此次流行的主要原因。反向遗传学操作技术已成为新型疫苗研制的重要手段。目前，将PEDV和BVDV进行结合的研究，尚未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒及应用，该猪源BVDV重组病毒可表达PEDVS外源蛋白，同时用于PEDV和BVDV的防控。此外，猪源BVDV重组感染性克隆为其他外源基因提供了合适的插入位点，可用作重组病毒载体，为后续体外修饰RNA、外源基因的插入、重组病毒的制备等研究提供有效的技术平台。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒，其在猪源BVDV的C核衣壳蛋白N端插入了猪流行性腹泻病毒S基因的中和抗原表位序列。进一步，所述猪流行性腹泻病毒S基因的中和抗原表位序列的插入位点为猪源BVDV的C核衣壳蛋白N端的第7和第8个氨基酸之间。又，所述猪源BVDV重组病毒的基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供一种含有所述重组病毒基因的猪源BVDV重组感染性克隆质粒。进一步，所述的猪源BVDV重组感染性克隆质粒为pASH-dS312。本专利技术所述猪源BVDV重组感染性克隆质粒的应用，所述猪源BVDV重组感染性克隆质粒线性化后，体外转录成RNA，并转染MDBK细胞，拯救出表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的猪源BVDV重组病毒。本专利技术提供猪源BVDV重组感染性克隆质粒的构建方法，包括如下步骤：1)根据猪源BVDV感染性克隆质粒的序列和PEDV流行株的S基因序列，设计重叠延伸PCR引物；2)利用重叠延伸PCR方法，将PEDVS基因中长度为312bp的抗原表位片段串联在一起，获得dS312片段；3)将dS312片段插入猪源BVDV感染性克隆质粒，插入位点为猪源BVDV感染性克隆质粒的C核衣壳基因N端第7和第8个氨基酸之间，获得猪源BVDV重组感染性克隆质粒。进一步，所述猪源BVDV感染性克隆质粒为pASH28。又，步骤3)中，获得的猪源BVDV重组感染性克隆质粒为pASH-dS312。进一步，所述重叠延伸PCR引物包括四对引物对，分别为：XhoI-F和COE-R1、COE1-F1和COE1-R1、COE2-F2和COE2-R2、COE-F3和PmlI-R，从5’端到3’端，引物对的具体序列如下：XhoI-F：GGAAGTCGTCAATGGTTCG；COE-R1：TGATGGCAAAGTACCCTTACCCCCTTC；COE1-F1：AGGGGGTAAGGGTACTTTGCCATCATTC；COE1-R1：TGATGGCAAAGTGTAACCAAAAAGAT；COE2-F2：CTTTTTGGTTACACTTTGCCATCATTCA；COE2-R2：CCCTTCATCAGAGTAACCAAAAAGAT；COE-F3：TCTTTTTGGTTACTCTGATGAAGGG；PmlI-R：GTTTGTTCCACTCATGCCTTTG。本专利技术的重组病毒包含了猪源BVDV的全长序列，插入了猪流行性腹泻病毒S基因的中和抗原表位序列，插入位点为BVDV的C核衣壳基因N端第7和第8个氨基酸之间，该猪源BVDV重组病毒可表达PEDVS外源蛋白，同时用于PEDV和BVDV的防控。本专利技术以BVDV感染性克隆质粒作为重组病毒载体，在猪源BVDV感染性克隆质粒的衣壳蛋白基因N端插入猪流行性腹泻病毒S基因，获得重组感染性克隆质粒，该质粒线性化后，体外转录成RNA，并转染MDBK细胞，能成功拯救出表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的猪源BVDV重组病毒。由于PEDV和BVDV都会导致猪腹泻，因此，以BVDV为载体构建的重组病毒，可以起到同时防治PEDV和BVDV的作用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术将PEDV的S基因插入猪源BVDV感染性克隆质粒的C核衣壳蛋白N端，获得重组感染性克隆质粒，拯救了表达PEDVS蛋白的猪源BVDV重组病毒，该猪源BVDV重组病毒可表达PEDVS外源蛋白，同时用于PEDV和BVDV的防控。本专利技术的猪源BVDV重组感染性克隆为其他外源基因提供了合适的插入位点，可用作重组病毒载体，为后续重组病毒疫苗研制提供契机和平台。附图说明图1为本专利技术实施例中PEDVdS312抗原的重叠延伸PCR结果。图2本专利技术实施例中重组T载体质粒的鉴定。图3本专利技术实施例中重组感染性克隆质粒的鉴定。图4本专利技术实施例中重组病毒的RT-PCR检测。图5本专利技术实施例中重组病毒的间接免疫荧光检测。图6本专利技术实施例中重组病毒的SDS-PAGE电泳鉴定。图7-8本专利技术实施例中重组病毒的westernblot鉴定。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。DL15,000DNAmarker、pfu聚合酶、Trizol、ReverseTranscriptaseM-MLV(RNaseH-)、5×ReverseTranscriptaseM-MLVBuffer、RecominantRnaseInhibitor、dNTPMixture(各2.5mM)、限制性内切酶均购自TaKaRa公司；DMEM培养基和Opti-MEM培养基购自Gibco公司；SpinMiniprepKit购自QIAGEN公司；MEGAscriptT7购自Ambion公司；脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自博士德公司；其他常规试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒，其在猪源BVDV的C核衣壳蛋白N端插入了猪流行性腹泻病毒S基因的中和抗原表位序列。

【技术特征摘要】
1.表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒，其在猪源BVDV的C核衣壳蛋白N端插入了猪流行性腹泻病毒S基因的中和抗原表位序列。2.根据权利要求1所述表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒，其特征在于，猪流行性腹泻病毒S基因的中和抗原表位序列的插入位点为猪源BVDV的C核衣壳蛋白N端的第7和第8个氨基酸之间。3.根据权利要求1所述表达猪流行性腹泻病毒S基因的猪源BVDV重组病毒，其特征在于，其基因序列如SEQIDNO.1所示。4.一种含有权利要求1所述重组病毒基因的猪源BVDV重组感染性克隆质粒。5.根据权利要求4所述的猪源BVDV重组感染性克隆质粒，其特征在于，所述质粒为pASH-dS312。6.如权利要求4所述猪源BVDV重组感染性克隆质粒的应用，所述猪源BVDV重组感染性克隆质粒线性化后，体外转录成RNA，并转染MDBK细胞，拯救出表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的猪源BVDV重组病毒。7.如权利要求4所述猪源BVDV重组感染性克隆质粒的构建方法，包括如下步骤：1)根据猪源BVDV感染性克隆质粒的序列和PEDV流行株的S基因序列，设计重叠延伸PCR引物；2)利用重叠延伸PCR方法，将PEDVS基因中长度为312bp的抗原表位片段串联在一起，获得dS312片段；3)将dS312片段插入猪源BVDV感染性克隆质粒，插入位点为猪源BVDV感染性克隆质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘惠莉，陶洁，李本强，程靖华，石迎，饶柏钟，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31