一种基于糖蛋白密码子优化的狂犬病新型重组疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种基于糖蛋白密码子优化的狂犬病重组疫苗，它是以LBNSE‑GL‑G为母本毒株，将LBNSE‑GL‑G株的G基因依据鼠源密码子偏爱性进行序列优化得到OG基因，将LBNSE‑GL‑G株基因组中的两个G基因替换为OG基因，通过反向遗传操作拯救重组病毒，得到LBNSE‑OGL‑OG狂犬病重组疫苗株，所述OG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该重组病毒LBNSE‑OGL‑OG具有良好的增殖特性和安全性，并且提高了狂犬病毒糖蛋白的表达量，灭活后肌肉免疫可以增强机体的免疫反应，诱导高水平的中和抗体，提高机体保护率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于糖蛋白密码子优化的狂犬病新型重组疫苗
本专利技术涉及狂犬病疫苗，尤其是一种糖蛋白密码子优化的新型狂犬病重组疫苗株。
技术介绍
狂犬病是由狂犬病毒(Rabiesvirus，RABV)引起的一种人畜共患传染病，一旦发病死亡率接近100％，严重威胁着人畜安全。近些年，我国平均每年约有700人左右死于狂犬病，位居传染病死亡人数前三位，95％的人类狂犬病死亡是因为带病毒的犬咬伤造成。而在暴露前和暴露后及时接种疫苗可以有很好的保护作用，当前广泛应用的狂犬病疫苗主要是原代细胞培养疫苗和传代细胞纯化疫苗等灭活疫苗，这些疫苗虽然具有安全、有效等优点，但灭活疫苗免疫原性较低，生产工程中往往需要进行病毒浓缩，提高了疫苗生产成本，阻碍了其在发展中国家的使用。另外，对于一些流浪动物及野生动物的免疫接种很难实现，而流浪狗、猫等动物为我国目前主要的传染源，对流浪动物的有效免疫是我国狂犬病防控的关键。因此，发展低毒、高免疫原性的狂犬病疫苗是当前主要目标之一。反向遗传操作技术的成熟使我们可以更有针对性地对狂犬病毒基因组进行改造以改变病毒的生物学特性，达到增强其安全性及免疫原性的目的。在许多欧美国家，重组狂犬病病毒疫苗已开始应用于狂犬病防控。目前应用的重组狂犬病病毒疫苗包括SADB19株、RC-HL株(ItoH,MinamotoN,WatanabeT,GotoH,RongLT,SugiyamaM,KinjoT,MannenK,MifuneK,KonobeT,etal.AuniquemutationofglycoproteingeneoftheattenuatedRC-HLstrainofrabiesvirus,aseedvirususedforproductionofanimalvaccineinJapan.MicrobiolImmunol.1994,38:479–482.)、HEP-Flury株(InoueKi,ShojiY,KuraneI,IijimaT,SakaiT,MorimotoK.AnimprovedmethodforrecoveringrabiesvirusfromclonedcDNA.JVirolMethods.2003Feb；107(2):229-36.)等。其中SADB19株是1994年Schnell等第一次运用反向遗传技术成功改造并拯救出的狂犬病毒株(SchnellMJ1,MebatsionT,ConzelmannKK.InfectiousrabiesvirusesfromclonedcDNA.EMBOJ1994,13(18):4195-203.)。随后以这些病毒为母本，通过反向遗传学系统构建表达双份狂犬病毒糖蛋白的重组病毒，如LBNSE-GL-G株(MuhammadTariqNavid,YingyingLi,LingZhao,etal.Comparisonoftheimmunogenicityoftwoinactivatedrecombinantrabiesvirusesoverexpressingtheglycoprotein.ArchVirol(2016)161:2863–2870.)、RC-HL株(Hosokawa-Muto,J，Ito,N，Minamoto,N,etal.Characterizationofrecombinantrabiesviruscarryingdoubleglycoproteingenes.MicrobiolImmunol.2006；50(3):187-196)、HEP-dG株(XiaohuiLiu,YoutianYang,XiaofengGuo,etal.ARecombinantRabiesVirusEncodingTwoCopiesoftheGlycoproteinGeneConfersProtectioninDogsagainstaVirulentChallenge.PLoSOne.2014；9(2):e87105.)。这些重组病毒表明：狂犬糖蛋白表达量的提高有助于降低狂犬病毒致病性并提高狂犬病毒灭活疫苗免疫原性。但狂犬病毒基因组所能容纳的外源基因大小及数量有限，而依据密码子偏爱性进行基因序列优化的方式可以提高基因mRNA翻译水平以进一步提高蛋白表达量。2011年，Schnell采用密码子优化的方式在不改变狂犬N2c病毒糖蛋白序列的同时增加了糖蛋白的表达量，得以进一步探究狂犬病毒糖蛋白表达量与病毒致病性的关系(Wirblich,SchnellMJ.RabiesVirus(RV)GlycoproteinExpressionLevelsAreNotCriticalforPathogenicityof.JournalofVirology.2011；85(2):697-704.)。另外，密码子优化在提高疫苗免疫原性方面也已有报导，如在流感疫苗的研发中优化流感凝集素基因可以提其表达量并增高疫苗免疫原性(FedorovaEF,KiselevaIV,RudenkoLG，etat.Codonoptimizationofhemagglutininasapromisingtoolforimprovingoftheinfluenzavaccinesimmunogenicity.MolGenMikrobiolVirusol.2014；(4):3-9.)。由此可见，将密码子优化与反向遗传操作系统结合对狂犬病毒改造在降低狂犬病毒致病性及提高免疫原性方面有潜在的应用价值，但是截至目前，尚无将此技术用于提高狂犬病疫苗免疫原性的报导。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于糖蛋白密码子优化的新型狂犬病重组疫苗，以提高狂犬病灭活疫苗的免疫原性。本专利技术的上述目的通过以下技术方案来实现：以之前报道的狂犬病疫苗株LBNSE-GL-G为母本病毒(MuhammadTariqNavid,YingyingLi,LingZhao,etal.Comparisonoftheimmunogenicityoftwoinactivatedrecombinantrabiesvirusesoverexpressingtheglycoprotein.ArchVirol(2016)161:2863–2870.)，将LBNSE株糖蛋白依据鼠源密码子偏爱性进行优化得到OG，分别替换LBNSE-GL-G中的两个G基因，通过反向遗传操作技术拯救重组病毒LBNSE-OGL-OG。该病毒株具有较高的病毒滴度，且致病性低，灭活后免疫能提高机体免疫后的中和抗体水平，提高机体保护率。所用的LBNSE毒株来源于用于欧洲野生动物免疫用的疫苗株SAD-B19，但在SAD-B19病毒G蛋白上将194位的天冬氨酸(AAT)突变为丝氨酸(TCC)，将333位的精氨酸(AGA)突变为谷氨酸(GAA)，相当于另一株疫苗株SAG2(在欧洲广泛用于野生动物口服免疫的疫苗株)，大大减弱了病毒的致病性(WenY,WangH,WuH,YangF,TrippRA,etal.(2011)Rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponset本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于糖蛋白密码子优化的狂犬病重组疫苗，其特征在于：它是以LBNSE‑GL‑G为母本毒株，将LBNSE‑GL‑G株的G基因依据鼠源密码子偏爱性进行序列优化得到OG基因，将LBNSE‑GL‑G株基因组中的两个G基因替换为OG基因，通过反向遗传操作拯救重组病毒，得到LBNSE‑OGL‑OG狂犬病重组疫苗株，所述OG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于糖蛋白密码子优化的狂犬病重组疫苗，其特征在于：它是以LBNSE-GL-G为母本毒株，将LBNSE-GL-G株的G基因依据鼠源密码子偏爱性进行序列优化得到OG基因，将LBNSE-GL-G株基因组中的两个G基因替换为OG基因，通过反向遗传操作拯救重组病毒，得到LBNSE-OGL-OG狂犬病重组疫苗株，所述OG基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.如权利要求1所述的基于糖蛋白密码子优化的狂犬病重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凌，裴捷，阮俊程，傅振芳，周明，李莹莹，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42