本发明专利技术提供了一种树枝状DNA组装体的制备方法及其用途，该树枝状DNA组装体的制备方法包括如下步骤：将若干条单链DNA混合于缓冲液中，升温至90℃后，以不超过3.6℃/min的速率降温至4℃，得到所述树枝状DNA组装体。本发明专利技术还提供了一种该树枝状DNA组装体作为分子载体在成像、诊断和治疗中的用途。本发明专利技术的优点在于：通过对单链DNA混合物进行一步淬火处理即可得到结构精确可控的树枝状DNA组装体。
Preparation method and application of dendritic DNA assembly
The invention provides a preparation method of dendritic DNA assembly and its application. The preparation method of dendritic DNA assembly includes the following steps: mixing several single stranded DNA in a buffer solution, heating to 90 C, cooling to 4 C at a rate not exceeding 3.6 C/min, and obtaining the dendritic DNA assembly. The invention also provides an application of the dendritic DNA assembly as a molecular carrier for imaging, diagnosis and treatment. The invention has the advantages that dendritic DNA assemblies with precise and controllable structure can be obtained by one step quenching of a single strand DNA mixture.
【技术实现步骤摘要】
一种树枝状DNA组装体的制备方法及其用途
本专利技术涉及一种树枝状DNA组装体的制备方法及其用途，属于生物医药
技术介绍
2004年DanLuo研究课题组首次报道了树枝状DNA的组装结构和方法(NatureMaterials2004,3,38)，之后经过一些列的改进(Biomacromolecules2015,16,1095；AcsNano2014,8,6171；Angew.Chem.Int.Ed.2012,124,11433)，形成了现有的树枝状DNA组装体(DNAdendrimer)的方法。已有的技术通过三条单链DNA(20mM每条链)在磷酸盐缓冲溶液中(50mM,pH8.0，withNaCl100mM)升温到95℃，再以1℃/min的降温速率，降温到4℃，从而自组装(图1A)成基本的结构单元Y0，Y1，Y2，Y3。之后，经过一步一步的组装方法(step-by-step)，分别室温混合Y0和Y1(数量比1：3)1小时，得到第一代DNAdendrimer(G1)；室温混合G1和Y2(数量比1：6)1小时，得到第二代DNAdendrimer(G2)；室温混合G2和Y3(数量比1：12)1小时，得到第三代DNAdendrimer(G3)，示意图和产物结构如图1B所示。该设计方法中Y0的末端三个多余单链DNA序列一致；Y1，Y2，Y3的末端三个多余单链DNA序列，其中一个为与Yn-1互补配对，另外两个序列一致且与Yn+1的同样位置互补配对；而Y型重复单元的双链部分，对于Y0，Y1，Y2，Y3可以全部一样，也可以是不同序列。上述方法主要有两个不足之处：1.需要先制备基本单元(Y结构)，再分步组装成DNAdendrimer，过程繁琐，不适用于产业化制备；2.制备出的最终产物是具有特定三维结构的刚性分子，因而不适用于需要柔性结构应用。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种树枝状DNA组装体的制备方法及其用途。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种树枝状DNA组装体的制备方法，其包括如下步骤：将若干条单链DNA混合于缓冲液中，升温至90℃后，以不超过3.6℃/min的速率降温至4℃，得到所述树枝状DNA组装体。作为优选方案，所述短链DNA在缓冲液中的浓度以树枝状DNA组装体在缓冲液中的浓度为1nM～100mM为标准设置。短链DNA的序列可以完全不同，这样得到的产物是各向异性的；短链DNA的序列也可以部分相同，这样得到的产物结构对称。制备该类树枝状组装体所需要的最少短链DNA个数为每代4条DNA，在这种情况下，第n代结构与第n-1代相连区域的序列为统一的两种(一种5’到3’,一种3’到5’)，与第n+1代相连的区域序列也是统一的两种一种5’到3’,一种3’到5’)。作为优选方案，所述缓冲液中含有按如下浓度计的各组分：40mMTris、20mM乙酸、1mMEDTA、12.5mM～50mM的MgCl2。作为优选方案，所述降温速率为2min/℃。一种由前述制备方法得到的树枝状DNA组装体作为分子载体在成像、诊断和治疗中的用途。作为优选方案，所述分子包括小分子药物、核苷酸、蛋白质、多肽、多聚糖、基因编辑所用的CRISPR相关蛋白和核苷酸复合体中的一种。本专利技术的方法制得的树枝状DNA组装体结构细节如图1所示。一个典型的DNA组装体由中心结构(图2C)和重复的树枝状分枝(图2A)构成。中心结构决定重复分枝的数量，例如，一个2号中心结构(Core2)和两个分枝1(Branch1)，两个分枝2(Branch2)可以组装成一个完整的3代树枝状DNA组装体(D2-3)。命名法则Dn-G，D代表树枝状DNA(Dendrimer)，n代表组成中心结构的短链DNA数量，G代表最终产物的代数。由于DNA具有方向性(5‘到3’，或3‘到5’)，所以需要两种方向相反但结构完全相同的分支结构(Branch1和Branch2)。本专利技术的树枝状DNA组装体的结构设计与之前的结构设计最大的不同在于，本专利技术的设计中基本的组成单元是两条DNA，一条相对短的，一条相对长的。短的DNA一端的序列与长DNA中间的序列完全互补配对，这样组成的重复单元Gn(图2B红色部分)，一端有一条多余单链悬挂序列，与靠近中心的DNA(Gn-1)相连接，另一端有两个悬挂序列，与远离中心的DNA(Gn+1)相连接，以此方式成树枝状延伸。在此结构中，互补配对区域的碱基长度为≥10个碱基对；且此区域长度可调，从而可以调整产物尺度的大小。另外，如果需要制备更具柔性的树枝状DNA组装体，每条短链DNA互补配对区域都可以以一个腺嘌呤(adenine)隔开(图2B中黑色碱基)。因此，由于重复单元是两条单链DNA，产物最终结构分叉部分为产物提供柔性，额外的腺嘌呤间隔又进一步增加产物的柔性。也正是由于这种结构设计，此方法只需将单链DNA按一定比例混合，由90℃降温即可制得柔性树枝状DNA组装体。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1、只需对短链DNA混合物一步淬火即可获得结构精确可控的树枝状DNA结构；2、该方法所的产品较现有技术所的产品柔性更高。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为现有技术的树枝状DNA组装体的结构和制备方法；图2为本专利技术所用树枝状DNA组装体的结构和制备方法；(A)树枝状DNA组装体分枝的结构示意图。(B)举例说明第一代DNA分枝与第二代分枝之间连接的结构细节。(C)举例说明可用来做DNA组装体中心结构的DNA结构。(D)一步法制得树枝状DNA组装体示意图。DNA链之间的短线表示碱基互补配对。箭头方向表示从5’到3’方向；图3为本专利技术中实施例1制备的树枝状DNA组装体Branch1和Branch2的序列图谱；图4为本专利技术中实施例1中的D2-3的序列图谱；图5为本专利技术制备的树枝状DNA组装体的三维模拟和凝胶电泳表征图；(A)为其三维结构示意图，(B)树枝状DNA组装体凝胶电泳图，下方标注为产率；图6为本专利技术制备的树枝状DNA组装体中的D2-3的原子力显微镜(AFM)图；(A)原子力显微镜总览图。(B)单独一个D2-3的原子力显微镜图。(C)单独一个D2-3的原子力显微镜三维图。(D)B图中虚线部分高度图；图7为本专利技术制备的树枝状DNA组装体靶向运输模型小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)到宫颈癌肿瘤细胞(HeLa)；(A)具有肿瘤靶向小干扰RNA输送功能的树枝状DNA复合体结构示意图，及其凝胶电泳图。(B)Alexa647荧光标记的复合体与HeLa细胞共培养16小时后的激光共聚焦显微镜图。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)标记，肌动蛋白用异硫氰酸荧光素标记的鬼比环肽(Phaloidin-FITC)标记。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1本实本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种树枝状DNA组装体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将若干条单链DNA混合于缓冲液中，升温至90℃后，以不超过3.6℃/min的速率降温至4℃，得到所述树枝状DNA组装体。
【技术特征摘要】
1.一种树枝状DNA组装体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将若干条单链DNA混合于缓冲液中，升温至90℃后，以不超过3.6℃/min的速率降温至4℃，得到所述树枝状DNA组装体。2.如权利要求1所述的树枝状DNA组装体的制备方法，其特征在于，所述短链DNA在缓冲液中的浓度以树枝状DNA组装体在缓冲液中的浓度为1nM～100mM为标准设置。3.如权利要求1所述的树枝状DNA组装体的制备方法，其特征在于，所述缓冲液中含有按如下浓...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲁敬雄，曹玲燕，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31
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