一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括NID2正向引物序列为如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列为SEQ ID NO.2，荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB；此外还包括检测GAPDH的正向引物及探针，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH2O。本发明专利技术所用试剂盒检测灵敏性、特异性强。

【技术实现步骤摘要】
一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
膀胱癌(bladdercancer，BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占泌尿系肿瘤的首位，其发病率和复发率呈逐年增加的趋势。据统计，我国每年约有145000例患者死于膀胱肿瘤，其中男性发病率为女性的3～4倍。在来源于上皮组织的膀胱癌中，约90％为移行上皮癌；非上皮性膀胱肿瘤较少见，主要包括未分化癌、鳞状细胞癌、腺癌，根据细胞的分化程度可将其分为3级。浅表性膀胱癌早期诊断通常有较好的预后，然而，膀胱癌的复发率为60％～70％，居所有实体瘤的首位，其中11％的复发患者会发展为浸润性膀胱癌，患者术后通常需每年进行3～4次膀胱镜检查。早期发现膀胱癌可以增加手术保留膀胱的机会并提高患者总体生存率，因此，如何早期发现膀胱肿瘤以及术后如何早期检测到膀胱肿瘤的复发具有非常重要的临床意义。传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，费用高且会给患者带来一定痛苦，其结果可能会受操作者主观判断而带来一定的误差；而细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34％左右)。因此无创检测，高灵敏高特异性是未来膀胱癌检测和监控手段发展的方向。膀胱癌无创检测的关键在于寻找高灵敏高特异性生物标记物，目前这也是膀胱癌研究的一大热点。中国专利(CN104141009B)公开了一种早期膀胱癌的多靶标检测方法，通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测。其中，NID2的检测灵敏度仅为23.33％。通过检测多个标志物基因的甲基化水平，虽然可以有效提高对膀胱癌检测的灵敏度，但是由于做甲基化特异性荧光定量PCR所用试剂、仪器都较为昂贵，检测费用较高，无疑增加膀胱癌患者的就诊负担。因此，寻找灵敏度、特异性高，无需多个标志物同时检测，可降低检测费用的检测膀胱的方法或产品，是众多膀胱癌患者所亟需的。
技术实现思路
本专利技术主要目的是，提供了一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术目的之一，提供一种用于早期膀胱癌检测的引物及探针，所述引物序列如下：NID2的正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示；所述荧光探针序列为SEQIDNO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。本专利技术目的之二，提供所述引物及探针在制备用于早期膀胱癌检测的试剂盒的应用。本专利技术目的之三，提供一种试剂盒，其包括以上所述的引物及探针；此外还包括检测GAPDH的引物及探针，PCRMasterMix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH2O。本专利技术目的之四，提供一种上述试剂盒的使用方法，步骤如下：(1)样本中基因组DNA的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液，蛋白酶K，漂洗液和ddH2O提取，得基因组DNA溶液；(2)DNA甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组DNA溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的DNA；(3)将步骤(2)修饰后的DNA进行PCR扩增。本专利技术目的之五，提供所述的试剂盒在制备检测早期膀胱癌试剂中的应用。本专利技术目的之六，提供所述试剂盒在制备检测NID2甲基化试剂中的应用。本专利技术取得的有益效果：(1)本专利技术所用引物专一性强，采用本专利技术引物进行扩增，扩增条件易于摸索，特异性强，优于其它引物。(2)本专利技术所用试剂盒检测灵敏性、特异性强，高于现有技术中以NID2为标记物检测膀胱癌的灵敏性。(3)本专利技术设计引物通过检测单个基因(NID2)的甲基化程度进行膀胱癌的诊断，与采用多个标志物进行诊断的方法相比，可以大量减少检测所需工作量，并且可以降低检测成本，从而可以有助于减少患者的诊疗费用。(4)本专利技术试剂盒不仅可以发现膀胱癌，也可以发现癌前腺瘤，为通过摘除癌前腺瘤而预防膀胱癌提供了可能性；本专利技术试剂盒可以同时发现左右两侧膀胱肿瘤，减少检测盲区和漏诊。(5)本专利技术检测方法完全无创，仅需50mL尿液便可完成检测，同时可使无症状人群接受度高。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。正如
技术介绍
所述，寻找灵敏度、特异性高，无需多个标志物同时检测，可降低检测费用的检测膀胱的方法或产品，是众多膀胱癌患者所亟需的。为了解决这个问题，本专利技术目的之一，提供一种用于早期膀胱癌检测的引物及探针，所述引物序列如下：NID2的正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.3所示；所述荧光探针序列为SEQIDNO.4，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。本专利技术目的之二，提供所述引物及探针在制备用于早期膀胱癌检测的试剂盒的应用。本专利技术目的之三，提供一种试剂盒，其包括以上所述的引物及探针；此外还包括检测GAPDH的正向引物及探针，PCRMasterMix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH2O。检测GAPDH的正向引物及探针可采用本领域内已知的引物及探针即可。本专利技术目的之四，提供一种上述试剂盒的使用方法，步骤如下：(1)样本中基因组DNA的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液、蛋白酶K、漂洗液和ddH2O提取，得基因组DNA溶液；(2)DNA甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组DNA溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的DNA；(3)将步骤(2)修饰后的DNA进行PCR扩增。进一步，步骤(1)所述样本为尿沉淀细胞。进一步，PCR反应液为：PCRMasterMix20μL，引物及探针3μL，总量/人份233μL。进一步，PCR反应条件为：本专利技术目的之五，提供所述的试剂盒在制备检测早期膀胱癌试剂中的应用。本专利技术目的之六，提供所述试剂盒在制备检测NID2甲基化试剂中的应用。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本专利技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本专利技术的技术方案。实施例1用于检测膀胱癌尿沉淀细胞甲基化水平的引物和探针设计本专利技术根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列NID2基因序列，设计多组引物及探针，引物由TAKARA(宝生物工程有限公司)合成，探针由LifeTechnologies合成。经筛选获得特异性和灵敏度效果最优的引物序列如下:NID2正向引物序列为如SEQIDNO.1所示(5’-GGTTCGTTTTTTTTTAGGGCG-3’)，反向引物序列为SEQIDNO.2(5’-CCTACCCTAAAATCCCGAACG-3’)，荧光探针序列为SEQIDNO.3(5’-FAM-CCCTCGACCGCTTCGCTCCA-MGB-3’)；荧光探针SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于早期膀胱癌检测的引物及探针，其特征在于，所述引物序列如下：NID2正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。

【技术特征摘要】
2018.04.19 CN 20181035627761.一种用于早期膀胱癌检测的引物及探针，其特征在于，所述引物序列如下：NID2正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示；所述荧光探针序列为SEQIDNO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。2.一种如权利要求1所述的引物及探针在制备用于早期膀胱癌检测的试剂盒的应用。3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物及探针。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测GAPDH的正向引物及探针，PCRMasterMix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH2O。5.根据权利要求3所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵琦，钟明，
申请(专利权)人：安徽达健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34