一种MGMT启动子甲基化检测引物及其检测方法技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，本发明专利技术提供了一种检测MGMT基因启动子区甲基化水平的引物及其检测方法，采用焦磷酸测序法进行测序，高效检测目标区域CpG岛甲基化和非甲基化比例，评估MGMT启动子区甲基化水平，以达到预测胶质瘤病人的预后及制定个性化的化疗及用药方案的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种MGMT启动子甲基化检测引物及其检测方法
本专利技术涉及基因检测
，具体而言，本专利技术涉及一种胶质瘤MGMT基因甲基化检测引物及其检测方法。。技术背景胶质瘤是起源于神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤。恶性胶质瘤约占原发性恶性脑肿瘤的70％，年发病率约为5-7/10万人。MGMT全称O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNAmethyltransferase)，是唯一能将O6鸟嘌呤复合物从DNA上移除的蛋白，可保护染色体免受烷化剂的致突变、致癌和细胞毒作用的损伤。MGMT主要通过不可逆地将烷化基团从O6-mG转移到MGMT蛋白145位的半胱氨酸残基上而保护细胞免受烷化剂的损伤。在这一过程中，MGMT既作为甲基转移酶，又作为甲基受体蛋白，单独完成转移反应。MGMT蛋白在细胞内的修复作用能力，主要取决于其在细胞内的含量及合成速率。MGMT基因启动子甲基化状态与MGMT蛋白的表达关系密切，启动子甲基化是MGMT基因最常见的异常，多发生于MGMT基因启动子CpG岛，导致该基因转录停止，蛋白表达减少。通过研究肿瘤细胞株，发现正常表达MGMT的细胞株，其MGMT基因启动子区均未发生甲基化，而相反，MGMT表达水平下调的细胞株，其MGMT基因启动子区发生了过甲基化。通过检查239例肿瘤组织样本，发现MGMT基因启动子区甲基化与MGMT蛋白表达水平下调符合率高达83％，证明了MGMT基因启动子甲基化是细胞内缺乏MGMT蛋白的主要原因。MGMT基因启动子甲基化程度越高，预后越差，其对肿瘤病人的预后和生存期的预示作用较肿瘤的分级、临床、年龄等其他特征更有效。目前MGMT基因启动子甲基化检测常用方法有甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)、荧光定量法，基因芯片法等。上述这些方法往往存在着操作繁琐，检测周期长，假阳性高等不足之处，不适于临床诊断。因此临床上迫切需求一种具有检测时间迅速，假阳性率低且测序准确性高的检测引物和检测方法。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题就是，专利技术人提供一种一种胶质瘤MGMT基因甲基化检测引物，其中，所述引物包括重亚硫酸盐转化后MGMT基因启动子扩增引物对，分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，和重亚硫酸盐转化后MGMT基因启动子的测序引物，为SEQIDNO.3所示。本专利技术的第一个目的是提供一组特异性扩增MGMT启动子区的引物，其特征在于：用于扩增和检测MGMT基因启动子区的核苷酸扩增引物如下：正向引物：5’-TTCGGGTTAGGCGTATAGGG-3’，如SEQIDNO:1所示；反向引物：5’-CGACCCAAACACTCACCAAA-3’，如SEQIDNO:2所示；测序引物：5’-GTTTTTAGAACGTTTTGCGTTT-3’，如SEQIDNO:3所示；扩增序列为：SEQIDNO:5所示的MGMT启动子区序列(部分，重亚硫酸盐转化后)中第80位到473位核苷酸；其中所述MGMT启动子区序列(部分，重亚硫酸盐转化后)如SEQIDNO:5所示，该部分对应的MGMT启动子区序列(部分，重亚硫酸盐转化前)如SEQIDNO:4所示。专利技术人提供了一种人类组织样本中MGMT基因甲基化检测方法，其中，使用权利要求1所述的扩增引物对重亚硫酸盐转化后人胶质瘤MGMT基因启动子进行扩增，并使用所述测序引物对所检测的基因区域4个CpG位点的甲基化比例进行检测，通过测甲基化率测定MGMT基因在组织中表达水平。进一步地，在上述的人类组织样本中MGMT基因甲基化检测方法中，包括步骤：组织样本采集、液氮保存、基因组DNA提取、重亚硫酸盐转化，MGMT启动子区PCR扩增反应，焦磷酸测序反应和结果分析。优选地，上述方法的具体包括步骤：(1)收集胶质瘤患者肿瘤组织样本；(2)组织采集后快速液氮冷冻保存；(3)用有机溶剂抽提方法提取胶质瘤组织样本中基因组DNA，经乙醇洗涤，弃上清后干燥、溶解并测定浓度；(4)基因组DNA经过重亚硫酸盐转化，其中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U，PCR扩增后转变为T)，而甲基化的胞嘧啶(C)不变；(5)用权利要求1所述的引物进行PCR扩增反应，通过焦磷酸测序反应检测目标区域CpG岛甲基化水平。所述有机溶剂抽提法及重亚硫酸盐转化方法为本领域的常规技术方法。本专利技术的第三个目的是提供一种用于胶质瘤MGMT基因甲基化诊断的试剂盒，其特征在于：包含：(1)组织样本中基因组DNA提取试剂；(2)基因组DNA重亚硫酸盐转化及分离纯化试剂；(3)扩增MGMT基因启动子目标区域试剂及正向和反向扩增引物SEQID.NO1和SEQIDNO.2以及灭菌水；(4)纯化及分离单链DNA的试剂及测序英语SEQIDNO.3(5)检测MGMT基因启动子区甲基化的试剂；(6)表明焦磷酸测序所用的分析序列的说明书。根据市面上现有的提取试剂盒，专利技术人提供了一个甲基化的商用组合试剂盒。具体包含：(1)组织样本中基因组DNA提取试剂，具体包括：ProteinaseK、缓冲液GB、无水乙醇、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱液TE；(2)基因组DNA重亚硫酸盐转化及分离纯化试剂，具体包括BisulfiteMix、RNasefreewater、DNAProtectBuffer、BL缓冲液、BW缓冲液、BD缓冲液、EB洗脱液、carrierDNA；(3)扩增MGMT基因启动子目标区域试剂：2×MasterMix、10×Concentrate、3uM正向和反向扩增引物(如SEQIDNO1、SEQIDNO2所示)以及灭菌水；(4)纯化及分离单链DNA的试剂：SSHPbeads(StreptavidinSepharoseHighPerformancebeads)、bindingbuffer、测序引物(如SEQIDNO3所示)、AnnealingBuffer、70％(V/V)乙醇溶液；(5)检测MGMT基因启动子区甲基化的试剂，具体包括：酶E(固体粉末)、底物S(固体粉末)、四种dNTP、RNasefreewater；(6)表明焦磷酸测序所用的分析序列的说明书。上述未公布具体成分的试剂为市场上的商业试剂，见具体实施例。本专利技术进一步提供了上述胶质瘤MGMT基因甲基化检测引物在检测MGMT基因启动子甲基化中的应用。优选地，所述样品为生物样品，优选所述样品为组织样品，和更优选所述样品选自活组织检查样品。本专利技术的方法有较高的重复稳定性，不需重复实验。利用本方法提供的MGMT基因启动子区扩增及甲基化检测引物，构建胶质瘤组织样本MGMT基因甲基化检测试剂盒，可以准确可靠的预测胶质瘤患者替莫唑胺治疗效果及预后，为后期制定个体化的化疗及用药方案提供实验依据。具体实施方式下文中将对本专利技术的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。本文所涉及细胞生物学及分子生物学中的相关术语的定义参看如下著作：余龙等译的基因VIII，科学出版社出版(2005)，ISBN:978-7-03-014597-0；张瑾峰等译的细胞与分子生物学，中信出版社出版(2004)，ISBN:978-7-50本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶质瘤MGMT基因甲基化检测引物，其特征在于，所述引物包括重亚硫酸盐转化后MGMT基因启动子扩增引物对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，和重亚硫酸盐转化后MGMT基因启动子的测序引物，为SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种胶质瘤MGMT基因甲基化检测引物，其特征在于，所述引物包括重亚硫酸盐转化后MGMT基因启动子扩增引物对，分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，和重亚硫酸盐转化后MGMT基因启动子的测序引物，为SEQIDNO.3所示。2.一种人类组织样本中MGMT基因甲基化检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的扩增引物对重亚硫酸盐转化后人胶质瘤MGMT基因启动子进行扩增，并使用所述测序引物对所检测的基因区域4个CpG位点的甲基化比例进行检测，通过测甲基化率测定MGMT基因在组织中表达水平。3.根据权利要求2所述的MGMT基因甲基化检测方法，其特征在于，包括步骤：组织样本采集、液氮保存、基因组DNA提取、重亚硫酸盐转化，MGMT启动子区PCR扩增反应，焦磷酸测序反应和结果分析。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，包括步骤：(1)采集胶质瘤患者肿瘤组织样本；(2)组织采集后快速液氮冷冻保存；(3)用有机溶剂抽提方法提取胶质瘤组织样本中基因组DNA，经乙醇洗涤，弃上清后干燥、DNA溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱学庆，黄欣，秦炜，
申请(专利权)人：上海润达榕嘉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31