用于具有抗流感活性的化合物的测定制造技术

本发明专利技术提供一种鉴定能够抑制流感病毒核糖核蛋白(RNP)复合物中包含的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的至少一种活性的物质的方法，该方法包括或由以下组成：(a)提供包含所述RNP复合物的纯化的流感病毒的含水悬浮液；(b)向步骤(a)的所述悬浮液中加入(i)非离子或两性离子表面活性剂；和(ii)还原剂；(c)孵育步骤(b)中获得的混合物以获得流感病毒裂解物；(d)在允许测试物质与所述RNP复合物中包含的所述RdRp相互作用的条件下使步骤(c)中获得的流感病毒裂解物与所述测试物质接触，所述RNP复合物存在于所述流感病毒裂解物中；和(e)确定所述测试物质是否抑制所述RdRp的所述至少一种活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于具有抗流感活性的化合物的测定专利
本专利技术提供鉴定能够抑制流感病毒核糖核蛋白(RNP)复合物中包含的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的至少一种活性的物质的方法，该方法包括或由以下组成：(a)提供包含所述RNP复合物的纯化流感病毒的含水悬浮液；(b)向步骤(a)的所述悬浮液中加入(i)非离子或两性离子表面活性剂；和(ii)还原剂；(c)孵育步骤(b)中获得的混合物以获得流感病毒裂解物；(d)在允许所述测试物质与所述RNP复合物中包含的所述RdRp相互作用的条件下使步骤(c)中获得的流感病毒裂解物与测试物质接触，所述RNP复合物存在于所述流感病毒裂解物中；和(e)测定所述测试物质是否抑制所述RdRp的所述至少一种活性。本说明书中，引用了许多文献，包括专利申请和制造商手册。这些文献的公开内容虽然不被认为与本专利技术的可专利性相关，但在此通过引用整体并入。更具体地，所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独的文件被具体和单独地指出为通过引用并入。
技术介绍
流感病毒属于RNA病毒的正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。基于病毒核衣壳和基质蛋白的抗原差异，流感病毒进一步分为三种类型，即流感病毒A、B和C型病毒。所有流感病毒都有包膜，并且它们的基因组由8或7个单链、负义的RNA区段构成。这些病毒引起人和动物的呼吸道疾病，具有显著的发病率和死亡率。1918年的流感大流行，西班牙流感，已被认为已导致多达1亿人死亡。具有循环人类病毒的禽流感RNA片段的重配(reassortment)造成了1957年H2N2“亚洲流感”和1968年H3N2“香港流感”的另外两次大流行组。现在，世界各地的人们从各个角度面对流感的挑战：季节性流感疫情影响约5-15％的世界人口，年死亡率在从250,000到500,000范围。许多亚洲国家已报告禽流感病毒，主要是H5N1病毒的感染。尽管没有观察到频繁的人与人之间的传播，但禽流感感染严重，并且与感染者高达60％的高死亡率相关联。2009年，H1N1猪流感感染最初出现在北美，并演变成新的大流行。目前，季节性三价流感疫苗和对H5N1或猪流感特异的疫苗可用于或处于临床试验阶段。预防是一种有效的方法，至少在某些人群中，用于预防流感病毒感染及其潜在的严重并发症。然而，持续的病毒抗原性转移和漂移使得未来的循环流感菌株不可预测。此外，由于在大流行期间在相对短的时间内大规模生产疫苗的限制，非常需要其他抗流感方法如抗流感药物。在市场上，有两种类型的抗流感药物可用：神经氨酸酶抑制剂，如磷酸奥司他韦(Tamilflu)和扎那米韦(Relenza)；和M2离子通道阻滞剂，如金刚烷胺和金刚乙胺。为了提高目前抗流感药物的有效性并防止或减弱耐药病毒的出现，发现具有新的抗流感作用机制的化合物是非常有价值的，这些化合物可以单独用作治疗剂或预防剂，或与目前的抗流感药物联合使用。H5N1和相关的高致病性禽流感病毒可以获得突变，使它们更容易在人类之间传播，这似乎是现实的。此外，新的A/H1N1可能变得更具毒性，并且只有单点突变会足以赋予对奥司他韦的抗性(Neumann等人，Nature2009,18,459(7249),931-939)。这已经发生在最近已经鉴定的一些季节性H1N1株的情况下(Dharan等人，TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation,2009,301(10),1034-1041；Moscona等人，TheNewEnglandJournalofMedicine2009,360(10),953-956)。在这种情况下，生产和部署疫苗的不可避免的延迟可能在人类生命和社会破坏中造成灾难性代价。鉴于目前大流行H1N1猪流感，高致病性H5N1禽流感和抗药性季节性流感的感染风险升高，新型抗流感药物的开发再次变得高度优先考虑。在许多情况下，可以通过病毒蛋白的结构数据的可用性来促进抗病毒药物的开发。流感病毒表面抗原神经氨酸酶的结构数据的可用性，例如，导致了改进的神经氨酸酶抑制剂的设计(VonItzstein等人，Nature1993,363,418-423)。基于这种结构数据开发的活性化合物的实例包括扎那米韦(Glaxo)和奥司他韦(Roche)。然而，尽管这些药物可以导致疾病持续时间的减少，但仍然迫切需要也可以用于治愈这些疾病的改进的药物。含金刚烷的化合物如金刚烷胺和金刚乙胺是已用于治疗流感的活性化合物的另一个实例。然而，它们经常导致副作用并且已经发现在越来越多的病例中无效(Magden等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.2005,66,612-621)。更多非特异性病毒药物已被用于流感和其他病毒感染的治疗(Eriksson等人，Antimicrob.AgentsChemother.1977,11,946-951)，但由于副作用，它们的使用受到限制(Furuta等人，AntimicrobialAgentsandChemotherapy2005,981-986)。如上所述，正粘病毒科的流感病毒是负义ssRNA病毒。该组病毒的其他实例包括沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、Ophioviridae、Delta病毒(δvirus)、玻那病毒科(Bornaviridae),纤丝病毒科(Filoviridae),副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)和Nyamiviridae。这些病毒使用负义RNA作为其遗传物质。根据RNA的正负义或极性，单链RNA病毒被分类为正义或负义。在转录之前，RNA聚合酶的作用对于从负病毒RNA产生正义RNA是必需的。因此，单独的负义病毒的RNA(vRNA)被认为是非感染性的。三聚体病毒RNA依赖性RNA聚合酶，由聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)和聚合酶酸性蛋白(PA)亚基组成，负责病毒RNA基因组区段的转录和复制。聚合酶的两个关键结构域的结构数据，PB2亚基中的mRNA帽结合结构域(Guilligay等人，NatureStructural&MolecularBiology2008,15(5),500-506)和PA亚基中的内切核酸酶活性位点(Dias等人，Nature2009,458,914-918)已经变得可用。核糖核蛋白(RNP)复合物代表流感病毒的最小转录和复制机制。当包含在RNP复合物中时，聚合酶也称为vRNP酶。在复制过程中，病毒RNA聚合酶产生互补RNA(cRNA)复制中间体，其为vRNA的全长互补序列，用作合成vRNA新拷贝的模板。在转录期间，RNP复合物中包含的病毒RNA聚合酶使用5’加帽的RNA引物合成加帽且多腺苷酸化的mRNA。这个过程涉及被称做帽抢夺的机制。流感聚合酶使用宿主细胞转录物(加帽的前mRNA)作为合成病毒转录物的引物。核蛋白是病毒转录机制的重要组分。聚合酶复合物负责将单链负义病毒RNA转录成病毒mRNA并负责复制病毒mRNA，因此是开发新类化合物的有前景的起点，所述化合物可用于治疗流感(Fodor，Actavirologica2013,57,113-122)。这一发现被本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定能够抑制流感病毒核糖核蛋白(RNP)复合物中包含的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的至少一种活性的物质的方法，该方法包括或由以下组成：(a)提供包含所述RNP复合物的纯化的流感病毒的含水悬浮液；(b)向步骤(a)的所述悬浮液中加入(i)非离子或两性离子表面活性剂；和(ii)还原剂；(c)孵育步骤(b)中获得的混合物以获得流感病毒裂解物；(d)在允许测试物质与所述RNP复合物中包含的所述RdRp相互作用的条件下使步骤(c)中获得的流感病毒裂解物与所述测试物质接触，所述RNP复合物存在于所述流感病毒裂解物中；和(e)确定所述测试物质是否抑制所述RdRp的所述至少一种活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.05 EP 16154496.01.一种鉴定能够抑制流感病毒核糖核蛋白(RNP)复合物中包含的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的至少一种活性的物质的方法，该方法包括或由以下组成：(a)提供包含所述RNP复合物的纯化的流感病毒的含水悬浮液；(b)向步骤(a)的所述悬浮液中加入(i)非离子或两性离子表面活性剂；和(ii)还原剂；(c)孵育步骤(b)中获得的混合物以获得流感病毒裂解物；(d)在允许测试物质与所述RNP复合物中包含的所述RdRp相互作用的条件下使步骤(c)中获得的流感病毒裂解物与所述测试物质接触，所述RNP复合物存在于所述流感病毒裂解物中；和(e)确定所述测试物质是否抑制所述RdRp的所述至少一种活性。2.权利要求1所述的方法，其中所述活性选自转录、Cap结合、核酸内切酶活性、复制和聚合酶活性。3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤(e)中的所述确定包括定量转录和/或复制或由其组成。4.权利要求2或3所述的方法，其中步骤(e)包括(e1)添加至少一种放射性标记的核苷酸；(e2)允许转录和/或复制发生，使得放射性标记的核苷酸掺入转录或复制产物中；(e3)将步骤(e2)的产物沉淀在过滤器上；和(e4)定量保留在过滤器上的产物的放射性；优选通过闪烁计数。5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法不涉及将RNP复合物与存在于病毒裂解物中的其他病毒组分分离和/或所述方法不涉及在步骤(d)之前纯化步骤(c)的所述流感病毒裂解物。6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，(i)所述非离子表面活性剂选自聚氧乙二醇烷基醚；聚氧丙二醇烷基醚；葡萄糖苷烷基醚；聚氧乙二醇辛基酚醚；聚氧乙二醇烷基酚醚；甘油烷基酯；聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯；和脱水山梨糖醇烷基酯或这些化合...

【专利技术属性】
技术研发人员：石天来，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH