一种微生物谷氨酰胺转胺酶稳定性的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物谷氨酰胺转胺酶MTGase稳定性的检测方法，将MTGase溶液pH调节至5.0‑6.0，然后进行阳离子交换层析；洗脱缓冲液pH为8.0‑9.0，洗脱方法为线性洗脱，经平衡缓冲液和洗脱缓冲液pH梯度洗脱，分离得到MTGase的两个同分异构体(MTGase I1和MTGase I2)，根据MTGase I2/MTGase I1的比值可以测定MTGase的稳定性。本发明专利技术还公开了一种MTGase同分异构体的分离方法。本发明专利技术方法简单、快捷，灵敏度高，为MTGase的生产品控环节提供更方便、快捷、可靠的检测方法，同时对MTGase后期应用稳定性的控制提供技术保障。

【技术实现步骤摘要】
一种微生物谷氨酰胺转胺酶稳定性的检测方法
本专利技术涉及酶制品稳定性的检测，具体涉及一种MTGase稳定性的检测方法，属于酶学性质及分离纯化领域。
技术介绍
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，简称TGase，EC2.3.2.13)是一种催化酰基转移的转移酶，可催化蛋白质分子内和分子间ε-(γ-glutaminyl)lysine共价键的形成，从而催化蛋白质分子内、分子间发生交联，进而改变蛋白质的性质和功能。谷氨酰胺转氨酶广泛存在于植物、动物和微生物中。而微生物来源的谷氨酰胺转胺酶(microbialtransglutaminase,MTGase)相对于动植物来源的TGase，具有非钙离子依赖性、底物特异性低、成本低等特点，使得MTGase在各个领域得到广泛的应用，如应用于肉制品、水产制品、乳制品、植物蛋白等食品加工方面，主要是改变食品的机械性能、持水性、口感等性能。近年来，MTGase在纺织领域及生物医学领域也有着越来越广泛的应用，如MTGase被大量用于蛋白质或多肽与小分子、聚合物、化学材料、DNA及其他蛋白等物质的结合。很多研究者利用MTGase的交联性质，对治疗药物蛋白进行位点特异性修饰等。在纺织工业中，MTGase多用于羊毛织物的处理，还用于牛仔服饰的做旧处理等；羊毛中含有谷氨酰胺和赖氨酸残基，添加TGase可以减少加工过程中的纤维损伤和褪色情况。MTGase由于其化学本质为蛋白质，其本身在生产、销售和应用过程容易受各种因素影响而使酶活降低，所以在工业上提高MTGase的稳定性是所要解决的重大问题，需要在每个生产环节做到严格的把控。有学者致力于优良菌株的筛选，从而得到产稳定性较好的菌株；有学者则致力于菌株发酵工艺的优化，从而得到稳定的发酵工艺，减小发酵过程中的不稳定因素对MTGase稳定性的影响；有学者致力于发酵后工艺的优化，在发酵后处理中加入不同的稳定剂来保护MTGase，研究表明添加合适糖类、盐离子、氨基酸等物质可以提高MTGase的稳定性，从而减小发酵后处理对MTGase的影响；同时也有学者致力于MTGase长期稳定保存的研究，如降低保存温度，调节液体MTGase产品在合适的pH值，添加保护剂来增加MTGase的稳定性，延长保质期(专利公开号：CN104024406A、CN105462950A、CN1684593)。尽管很多学者对于MTGase的稳定性做了很多研究，但是在实际的生产和应用中仍然存在很多问题，如：(1)由于发酵工艺的不稳定，造成每批次发酵得到的MTGase稳定性存在一定差异；(2)MTGase本身为蛋白质，即使在发酵后处理、运输过程中严格控制操作环节，其稳定性仍然会受到外界不稳定因素的影响；(3)医药领域对MTGase的纯度、稳定性等方面有着严格的要求，MTGase的精细纯化过程可能会对MTGase的稳定性有影响，需要严格精确的稳定性鉴定方法来对符合要求的MTGase进行筛选；(4)目前MTGase粉末制剂虽然已经实现规模化生产，但生物酶制剂及各工业领域在向液体剂型发展，而液体状态下MTGase的稳定性相对于固体状态更不稳定，使得鉴定液体MTGase的稳定性成为更加关注的问题。据文献报道，由于蛋白质在折叠组装时的差异，同种蛋白质会存在不同的同分异构体，特别是生物医学领域所用到的抗体，不同的同分异构体抗体蛋白会有明显的性质差异，所以会对蛋白的同分异构体进行分离。通过我们的实验发现，MTGase也存在同分异构体，用阳离子交换层析方法进行pH梯度洗脱可以将MTGase的同分异构体进行分离。经过酶学性质检测发现，MTGaseI1和MTGaseI2在温度稳定性、pH稳定性、保存稳定性等方面存在显著的差异。目前还没有办法完全避免MTGase稳定性的差异，因此，寻找一种可以快捷、准确、高灵敏度的检测MTGase稳定性的方法至关重要，可以对发酵过程、发酵后处理环节、精细纯化环节生产得到的MTGase进行稳定性检测，一方面是对发酵过程的监控，一方面可以确定出厂的样品稳定性的大小，从而更好的指导客户进行使用。不同领域的客户也可以用该方法检测他们购买得到的MTGase的稳定性的高低，从而选择适合其自身产品的MTGase。在工厂生产MTGase的过程中，对MTGase只是进行简单的功能性检测。现有技术中还没有快捷、准确、灵敏度高的MTGase检测方法，可以测定MTGase的稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于结合离子交换分离方法，提供一个简单、快捷、灵敏度高的检测MTGase稳定性的方法。从而实时监控检测MTGase稳定性，建立更加严格的MTGase稳定性检测方法。本专利技术提出的微生物谷氨酰胺转胺酶MTGase稳定性的检测方法，包括以下步骤：(1)MTGase溶液的制备将MTGase溶解在缓冲液中，调节溶液pH为5.0-6.0之间，离心收集，得到MTGase上清液；本专利技术中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸盐缓冲液；优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。本专利技术中，所述缓冲液的浓度为15-50mM；优选地，为15-30mM；进一步优选地，为20mM。本专利技术中，所述MTGase的pH为5.0-6.0之间。所述MTGase的pH条件对其稳定性的鉴定起决定作用，要严格控制在所述pH5.0-6.0范围内。本专利技术中，所述MTGase终酶活浓度为3.0～30U/mL；优选地，为3.0～10U/mL；进一步优选地，为3.0-5.0U/mL；进一步优选地，3.0U/mL、5.0U/mL。本专利技术中，离心的条件可以采用常规的离心条件即可，包括但不限于是8000r/mim离心10～15min；优选地，8000r/mim离心10min。本专利技术中，所述离心的温度为4-20℃；优选地，为4℃。本专利技术中，所述MTGase可以但不限于是由茂源链霉菌所产的MTGase。本专利技术中，MTGase的存在形式可以是未经处理的发酵液，或为商品化的MTGase(如市面上购买的任何茂源链霉菌来源的MTGase，或精细纯化后高纯度的用于医药领域的茂源链霉菌来源的MTGase)。本专利技术中，若MTGase的存在形式为未经处理的微生物发酵液时，则可先将发酵液离心，收集上清，然后再溶解在缓冲液中，调节溶液pH为5.0-6.0之间，离心收集上清。或，先用预冷的无水乙醇处理发酵液，静置后，离心收集沉淀，得到MTGase的粗提物(或，再进行冷冻干燥，得到固体制剂的MTGase)，然后再溶解在缓冲液中，调节溶液pH为5.0-6.0之间，离心收集上清。其中，所述无水乙醇与发酵液的体积比为1:1。其中，所述静置的时间为0.5-1.5h，优选地为，1h。其中，各步骤所述离心的条件可以但不限于是8000r/mim离心10～15min；优选地，8000r/mim离心10min。(2)离子交换层析将步骤(1)制备得到的MTGase上清液进行离子交换层析。本专利技术中，所述离子交换层析为阳离子交换层析；如可以选用的阳离子交换层析纯化柱型号为HitrapSPSepharoseFastFlow(1mL)。本专利技术中，所述离子交换层析中采用的平衡缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸盐缓冲液；优选地，所述缓冲液磷酸盐缓冲液。本专利技术中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种MTGase稳定性的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)MTGase溶液的制备将MTGase溶解在缓冲液中，调节溶液pH为5.0‑6.0，离心收集，得到MTGase上清液；(2)离子交换层析将步骤(1)制备得到的MTGase上清液进行阳离子交换层析；(3)MTGase I2/MTGase I1的比值确定离子交换层析过程中，随着洗脱缓冲液的比例不断增加，洗脱得到的MTGase的pH不断增加，根据pH的变化可以分离得到MTGase的两个同分异构体MTGase I1和MTGase I2，分别根据洗脱峰计算峰积分面积，计算两个同分异构体的峰面积比值。

【技术特征摘要】
1.一种MTGase稳定性的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)MTGase溶液的制备将MTGase溶解在缓冲液中，调节溶液pH为5.0-6.0，离心收集，得到MTGase上清液；(2)离子交换层析将步骤(1)制备得到的MTGase上清液进行阳离子交换层析；(3)MTGaseI2/MTGaseI1的比值确定离子交换层析过程中，随着洗脱缓冲液的比例不断增加，洗脱得到的MTGase的pH不断增加，根据pH的变化可以分离得到MTGase的两个同分异构体MTGaseI1和MTGaseI2，分别根据洗脱峰计算峰积分面积，计算两个同分异构体的峰面积比值。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸盐缓冲液。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述pH为5.0-6.0。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述MTGase为由茂源链霉菌所产的MTGase。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，若MTGase的存在形式为未经处理的微生物发酵液时，先将发酵液离心，收集上清，然后溶解在缓冲液中，调节溶液pH为5.0-6.0之间，离心收集上清；或，先用预冷的无水乙醇处理发酵液，静置后，离心收集沉淀，得到MTGase的粗提物，然后再溶解在缓冲液中，调节溶液pH为5.0-6.0之间，离心收集上清。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述阳离子交换层析中采用的平衡缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸盐缓冲液，pH为5.0-6.0。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述阳离子交换层析中采用的洗脱缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸盐缓冲液；pH为8.0-9.0。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述样品上样的总蛋白量为5-20mg，总酶活为100-300U。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述同分异构体MTGaseI...

【专利技术属性】
技术研发人员：金明飞，王志珍，常忠义，高红亮，陈中山，王玲转，易正芳，步国建，
申请(专利权)人：华东师范大学，泰兴市东圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31