金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立技术

本发明专利技术涉及用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立，属于生物检测技术领域。本发明专利技术提供了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7 wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，并建立了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法。本发明专利技术的PCR检测方法灵敏度高且具有很好的重复性。

【技术实现步骤摘要】
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立
本专利技术属于生物检测
，具体涉及金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立。
技术介绍
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌这3种细菌是引起人类食源性疾病的重要病原菌。金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属成员，是革兰氏阳性球菌中的一种，绝大部分葡萄球菌属是不致病，少数可引起人类或动物致病，属于人畜共患致病菌。而金黄色葡萄球菌致病性最强，除了常引起皮肤、组织及器官的化胳性炎症外，其产生的肠毒素也可污染猪肉而导致食物中毒。大肠杆菌O157：H7是肠出血性大肠杆菌中的典型菌株，其具有较强的耐酸性，37℃下，在pH2.5-3.0时，可耐受5h。大肠杆菌O157：H7是重要的食源性致病菌，可以长期在动物体内存在，并不断从体内排出，对周围环境和动物胴体造成污染，很容易导致食品污染。沙门氏菌为两端钝圆的短杆菌，革兰氏阴性菌，无荚膜和芽胞，除鸡伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌外都有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛。其分为种抗原结构，菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)及表面抗原(Vi)。该菌对营养要求不高，在普通琼脂培养基上生长良好，需氧及兼性厌氧菌。生长温度范围为5-46℃，最适生长的温度为35-37℃，最适生长的pH为6.8-7.8，在液体培养基中呈混独生长。近年来，国内外对致病菌的检测一直是研究的热点，检测方法主要包括常规检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法等常规的PCR方法具有快速、准确、操作简单、灵敏度和特异性高、检测成本低等诸多优点，然而在食品生产和流通中，企业和政府部口均需对大批食品进行致病菌的检测，样品量大，时间急，同时，食品样品中往往存在的致病菌种类较多，而常规的PCR一次试验只能检测一种致病菌。单独的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌荧光定量PCR检测方法技术已经成熟并且有专门的检测试剂盒产品，但是还没有三种细菌的联合检测方法。若同一份样品需检测上述三种致病菌，则需要用不同的体系和样品量，即检测上述三种致病菌需要做三次试验，不利于大批量同时检测上述三种致病菌。因此亟需一套体系与方法能够检测出上述三种细菌的污染情况。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足而提供一种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立。本专利技术采用如下技术方案：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，所述三组引物和探针分别具有以下碱基对：以金黄色葡萄球菌nuc基因为对象：上游引物(5’-3’)TTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGC下游引物(5’-3’)TTGCACTATATACTGTTGGATCTTCAG探针(5’-3’)FAM-TGCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAG-BHQ1；以大肠杆菌0157：H7wzx基因为对象：上游引物(5’-3’)TCATGCACGCAATGATACTCAA下游引物(5’-3’)CGAACACTACTAATATGAAGGCCA探针(5’-3’)CY5-AGACGCTCAGAACATCATTGAAAATAGTGGG-BHQ2；以沙门氏菌invA基因为对象：上游引物(5’-3’)CCTGATCGCACTGAATATCGTACT下游引物(5’-3’)GTGGTAATTAACAGTACCGCAGGA探针(5’-3’)Vic-ATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGAC-BHQ1。所述的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法的建立中的应用，包括如下步骤：步骤一：设计所述三组引物和探针；步骤二：引物特异性检测；步骤三：金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7wzx基因、沙门氏菌invA基因的克隆及质粒提取鉴定；步骤四：对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌分别进行探针单重特异性测定；步骤五：探针法多重特异性检测；步骤六：多重条件探索；步骤七：标准曲线建立。更进一步地，步骤二中所述引物特异性检测时，PCR体系如下：PCR反应条件如下：大肠杆菌0157：H7和沙门氏菌的PCR反应条件：金黄色葡萄球菌的PCR反应条件：更进一步地，步骤四中所述单重特异性测定时，qPCR体系如下：qPCR条件如下：50℃，2min；95℃，5min；(95℃，40s；60℃，40s；)×40个循环。更进一步地，步骤五中所述探针法多重特异性检测时，将金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌放在同一个体系进行扩增，qPCR体系如下：更进一步地，步骤六中所述多重条件探索时，Mix固定30μL，探针设3个浓度(0.4μL、0.3μL、0.2μL)，最终选定探针浓度为0.4μL；探针固定为0.4μL，mix设30μL、40μL、mix35μL，最终选定mix浓度为30μL。更进一步地，步骤七中建立的标准曲线为：金黄色葡萄球菌：Y＝-4.929X+58.824R2＝0.999Eff％＝86.721沙门氏菌：Y＝-4.74X+57.046R2＝0.996Eff％＝90.775大肠杆菌O157H7：Y＝-4.277X+52.119R2＝0.997Eff％＝84.861。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：第一，本专利技术的PCR检测方法灵敏度高：金黄色葡萄球菌和沙门氏菌灵敏度为105copies/μL，而大肠杆菌灵敏度104copies/μL。第二，本专利技术建立的三重荧光RT-PCR具有很好的重复性，5个梯度批内变异系数处在0.09％-1.71％之间，小于10％，具有极高重复性，5个梯度批间变异系数处在0.05％-6.62％之间，小于15％-20％，具有极高重复性。附图说明图1为细菌引物特异性鉴定电泳图，其中M:500DNAMarker1、3、5：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌阴性对照，2、金黄色葡萄球菌(96bp)，4、大肠杆菌(104bp)，6、沙门氏菌(108bp)；图2为细菌目的基因质粒鉴定电泳图，其中M:2000DNAMarker1、金黄色葡萄球菌(96bp)，2、大肠杆菌(104bp)，3、沙门氏菌(108bp)，4、阴性对照；图3-1为金黄色葡萄球菌探针单重特异性结果图；图3-2为沙门氏菌探针单重特异性结果图；图3-3为大肠杆菌探针单重特异性结果图；图4为探针多重特异性结果图；图5-1为探针多重特异性mix固定探针摸索结果图(总图)；图5-2为mix固定为30μL，探针0.2μL摸索结果图(分图)；图5-3为mix固定为30μL，探针0.3μL摸索结果图(分图)；图5-4为mix固定为30μL，探针0.4μL摸索结果图(分图)；图6-1为探针多重特异性探针固定mix摸索结果图；图6-2为探针固定为0.4μL，mix为30μL摸索结果图；图6-3为探针固定为0.4μL，mix为35μL摸索结果图；图6-4为探针固定为0.4μL，mix为40μL摸索结果图；图7-1为三种菌标准曲线图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，所述三组引物和探针分别具有以下碱基对：以金黄色葡萄球菌nuc基因为对象：上游引物(5’‑3’)TTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGC下游引物(5’‑3’)TTGCACTATATACTGTTGGATCTTCAG探针(5’‑3’)FAM‑TGCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAG‑BHQ1；以大肠杆菌0157：H7wzx基因为对象：上游引物(5’‑3’)TCATGCACGCAATGATACTCAA下游引物(5’‑3’)CGAACACTACTAATATGAAGGCCA探针(5’‑3’)CY5‑AGACGCTCAGAACATCATTGAAAATAGTGGG‑BHQ2；以沙门氏菌invA基因为对象：上游引物(5’‑3’)CCTGATCGCACTGAATATCGTACT下游引物(5’‑3’)GTGGTAATTAACAGTACCGCAGGA探针(5’‑3’)Vic‑ATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGAC‑BHQ1。...

【技术特征摘要】
1.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，所述三组引物和探针分别具有以下碱基对：以金黄色葡萄球菌nuc基因为对象：上游引物(5’-3’)TTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGC下游引物(5’-3’)TTGCACTATATACTGTTGGATCTTCAG探针(5’-3’)FAM-TGCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAG-BHQ1；以大肠杆菌0157：H7wzx基因为对象：上游引物(5’-3’)TCATGCACGCAATGATACTCAA下游引物(5’-3’)CGAACACTACTAATATGAAGGCCA探针(5’-3’)CY5-AGACGCTCAGAACATCATTGAAAATAGTGGG-BHQ2；以沙门氏菌invA基因为对象：上游引物(5’-3’)CCTGATCGCACTGAATATCGTACT下游引物(5’-3’)GTGGTAATTAACAGTACCGCAGGA探针(5’-3’)Vic-ATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGAC-BHQ1。2.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法的建立中的应用，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：设计所述三组引物和探针；步骤二：引物特异性检测；步骤三：金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7wzx基因、沙门氏菌invA基因的克隆及质粒提取鉴定；步骤四：对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌分别进行探针单重特异性测定；步骤五：探针法多重特异性检测；步骤六：多重条件探索；步骤七：标准曲线建立。3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄梅清，郑敏，陈秀琴，蔡羲，吴南洋，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35