本发明专利技术公开了在RAW 264.7细胞分化为破骨细胞过程中miR‑218下调。miR‑218过表达抑制破骨细胞的分化，而抑制miR‑218表达则促进这一过程。生物信息学分析和荧光素酶报告基因表明，TNFR1是miR‑218的靶基因。因此，miR‑218通过靶向TNFR1抑制NF‑κB信号通路的调节负性调节破骨分化，提示靶向miR‑218可能成为绝经后骨质疏松症的潜在治疗方法，可以应用于制备治疗绝经后骨质疏松症的药物。
Application of miR-218 in the preparation of drugs for osteoporosis
MiR 264.7 218 is downregulated during the differentiation of RAW cells into osteoclasts. MiR 218 overexpression inhibits osteoclast differentiation and inhibits miR 218 expression. Bioinformatics analysis and luciferase reporter gene showed that TNFR1 was the target gene of miR 218. Therefore, the negative regulation of osteoclast differentiation by targeting TNFR1 inhibits NF_kappa B signaling pathway suggests that targeting microRNAs may be a potential therapy for postmenopausal osteoporosis and can be used to prepare drugs for postmenopausal osteoporosis.
【技术实现步骤摘要】
miR-218在制备治疗骨质疏松症药物中的应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及miR-218在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
技术介绍
绝经后骨质疏松症是一种常见的疾病，与雌激素缺乏有关，导致骨丢失和骨组织改变，引起骨质脆弱和骨折风险增加，严重影响老年人的健康和生活质量，已成为当今重要的健康问题。绝经后骨质疏松症的特点是骨密度降低，骨结构恶化，骨骼脆弱，导致脆性骨折的风险增加。绝经后骨质疏松症主要是由于破骨细胞骨吸收与成骨细胞骨形成平衡失调所致。microRNA（miRNA）是一类由内源性基因编码的非编码单链RNA分子，约有22个核苷酸，在各种生物的发展中起着重要的调节作用过程。miRNAs主要通过基因的转录后调控来调控靶基因的表达，从而参与肿瘤发生、生物发育、器官发生、病毒防御和代谢。近期有研究表明，miRNAs可以参与到破骨细胞的成熟分化中。通过靶向结合PDCD4（程序性细胞死亡蛋白4），miR-21可以调控骨髓来源的单核/巨噬细胞前体细胞的破骨细胞分化途径，而在破骨细胞前体细胞株RAW364.7的检测中，研究人员发现miR-223在其中表达并且可以通过抑制NF1-A（核因子1A）以及M-CSFR（巨噬细胞集落刺激因子受体）水平来调控破骨细胞的分化发育。相反的，miR-155在巨噬细胞中呈高水平表达，而在诱导向破骨细胞分化过程中表达逐渐降低，提示其可能在破骨细胞分化过程中可能扮演抑制因子的作用。因此miRNAs在骨质疏松相关的破骨细胞分化中起着重要的调控作用，而其作用机制也有待我们进一步研究。目前，对miR-218的研究主要集中在对肿瘤的发生发展过程中的作用，研究发现：miR-218是一种肿瘤抑制子，具有阻止组织神经胶质瘤细胞迁移、迁徙、增殖和癌细胞干细胞的功能。然而，miR-218对破骨细胞的调控机制尚不明确，因此探讨miR-218对破骨细胞分化的作用和其中的分子机制显然具有十分重要的理论意义和应用价值，有助于为绝经后骨质疏松症的治疗提供新思路，并有可能成为绝经后骨质疏松症治疗的有效手段。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术目的在于针对现有技术的不足，研究在破骨细胞中miR-218的调控机制，提供miR-218在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。本专利技术的另一目的是提供miR-218通过调控靶基因TNFR1在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。技术方案：本专利技术的目的通过下述技术方案实现：miR-218在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。所述骨质疏松症为绝经后妇女骨质疏松症。所述miR-218前体序列为：5′-TTGCGGATGGTTCCGTCAAGCA-3′。本专利技术还提供一种治疗骨质疏松症的试剂或药物，所述试剂或药物包含：（a）miR-218模拟物和/或miR-218激动剂；（b）药剂学上能接受的病毒、载体和/或辅料。有益效果：本专利技术研究了当RAW264.7细胞分化为破骨细胞过程中miR-218的水平变化；并在RAW264.7细胞中转染miR-218模拟物或抑制剂，研究了在破骨分化中miR-218的作用；采用生物信息学分析和荧光素酶报告基因来识别和验证miR-218的靶基因。本专利技术发现在RAW264.7细胞分化为破骨细胞过程中miR-218下调。miR-218过表达抑制破骨细胞的分化，而抑制miR-218表达则促进这一过程。生物信息学分析和荧光素酶报告基因表明，TNFR1是miR-218的靶基因。因此，miR-218通过靶向TNFR1抑制NF-κB信号通路的调节负性调节破骨分化，提示靶向miR-218可能成为绝经后骨质疏松症的潜在治疗方法。附图说明图1（A）为TRAP染色证实破骨细胞分化（0、1、3、5天）；图1（B）为NFATC1和TRAF-6蛋白表达水平的变化（0、1、3、5天）；图1（C）为NFATC1和TRAF-6mRNA在破骨分化0、1、3、5天的表达。图1（D）为miR-218的表达在破骨分化0、1、3、5天的表达。n＝3（与对照组相比p＜0.05）。图2（A）左图为光镜下观察转染效率，右图为qRT-PCR方法检测RAW264.7细胞转染miR-218模拟物、抑制剂，或miR-NC时miR-218表达水平的变化；图2（B）为RAW264.7细胞转染miR-218模拟物，抑制剂，或miR-NC后用RANKL诱导后3天行TRAP染色；图2（C）为PCR检测NFATc1和TRAF6表达水平在miR-218模拟物，抑制剂，或miR-NC组的改变。图2（D）为WB检测NFATc1和TRAF6蛋白表达水平在miR-218模拟物、抑制剂，或miR-NC组的改变。n＝3（与NC相比，p＜0.05）。图3（A）为TargetScan,miRanda,andPicTar预测潜在的靶基因；图3（B）示意图显示TNFR13′-UTR有miR-218的结合位点；图3（C）为共转染HEK293T细胞TNFR13′UTR荧光素酶报告（野生型或突变型中的结合位点）；表达显著抑制WTTNFR13′UTR荧光素酶活性。n＝3（与空白组相比，p＜0.05）。图4（A）为WB检测TNFR1、p65和ph-p65表达谱在破骨分化0、1、3和5天的变化。图4（B）为WBTNFR1，p65，ph-p65在miR-218模拟物、抑制剂，或miR-NC组的变化。n＝3（与NC相比，p＜0.05）。图5为miR-218对破骨细胞分化调控机制。具体实施方式下面通过附图对本专利技术技术方案进行详细说明，但是本专利技术的保护范围不局限于所述实施例。实验方法：材料：RAW264.7细胞（小鼠破骨细胞前体细胞）用于破骨分化的研究，从富恒细胞中心（上海，中国）购买。用核因子κB配体受体激活剂（RANKL）（50ng／ml）刺激细胞破骨分化（诱导时间0、1、3、5天）。在标准细胞培养条件下（5%的CO2和95%的湿度）培养细胞。通过TRAP染色和检测破骨细胞分化标记基因（TRAF6和NFATc1）的表达来验证诱导成功的破骨细胞。通过光学显微镜下计数TRAP染色阳性的多核破骨细胞（>3核）。miRNA模拟物或抑制剂的转染荧光标记的miR-218的模拟物、抑制剂和阴性对照（miR-NC）由RiboBio（广州，中国）合成。RAW264.7细胞接种于六孔板（20×104细胞/孔）通过Lipo3000分别转染100nm的miR-218模拟物，150nm的miR-218抑制剂和miR-NC。36小时孵育后，在荧光显微镜下观察转染效率。然后将细胞新鲜培养基中培养，通过RANKL孵育3天。miRNA的提取用Trizol从收集的分化了0、1、3、5天的细胞中提取总RNA。简而言之，细胞收集在EP管，用1毫升/管Trizol裂解，然后加入三氯甲烷（0.2毫升/毫升Trizol）。离心12000转4°C15分钟后，弃上清液到新的EP管中混合异丙醇（0.5毫升/毫升Trizol）。然后，将混合物于12000rpm离心4°C10分钟；上层水相被丢弃得RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇洗两次，于12000rpm离心4°C15分钟去除上层水相后，RNA沉淀在空气中干燥，在室温下，用20–50µlDEPC水溶解RNA沉淀。总RNA用于RT-qPCR分析。RT-q本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.miR‑218在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.miR-218在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨质疏松症为绝经后妇女骨质疏松症。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-218前体序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：张宏秀，王韦韦，杨雷，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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