巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测试剂盒，其包括装有多态性检测引物和内控基因检测引物的试管，其中，所述多态性检测引物包括序列如下的引物组分：多态性检测引物一：5′‑GGATGGGAAA TCAAAGCAG‑3′；多态性检测引物二：5′‑GATGGGAAAT CAAAGCGC‑3′；多态性检测引物三：5′‑CAGATCCAAC TCCACCT‑3′；所述内控基因检测引物包括序列如下的引物组分：内控引物一：5’‑AGCAAGCAGG AGTATGACG‑3'；内控引物二：5'‑GAAAGGGTGT AACGCAACT‑3'。与现有技术相比，本发明专利技术在检测新鲜血液等样本的GABBR1基因突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。

Baclofen drug related gene GABBR1 gene polymorphism detection kit

The invention relates to a baclofen drug-related gene GABBR1 gene polymorphism detection kit, which comprises a test tube containing polymorphism detection primers and an internal control gene detection primer, wherein the polymorphism detection primer comprises a primer component sequence as follows: a polymorphism detection primer 1: 5'GGATGGAAA TCAAAGCAG 3'; Polymorphism detection primer 2: 5'GATGGAAAT CAAAGCGC_3'; polymorphism detection primer 3: 5'CAGATCCAAC TCCACCT Compared with the prior art, the invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity and short time-consuming in detecting the mutation of GABBR1 gene in fresh blood and other samples.

【技术实现步骤摘要】
巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的引物组合物、试剂盒和方法。
技术介绍
巴氯芬(baclofen)是解痉药，为γ-氨基丁酸(GABA)的衍生物，具骨骼肌松弛作用。其作用机制为通过刺激GABA受体，抑制兴奋性氨基酸的释放，抑制脊髓内单突触和多突触传递，而起到缓解骨骼肌痉挛状态、降低肌张力、改善使肌力等作用。在临床上用于多发性硬化症引起的骨骼肌痉挛，感染性、退行性、外伤性、肿瘤或原因不明的脊髓疾病引起的痉挛状态，脑源性肌痉挛等。GARBB1是GABA的其中一种受体，定位于人类染色体6p21.3，含22个外显子，研究发现GARRB1rs29220可以预测巴氯芬的治疗效果，该位点杂合子基因的携带者使用巴氯芬的治疗效果显著下降，纯合子与野生型基因的携带者对巴氯芬的疗效无明显差异。因此，通过检出GARRB1rs29220突变可以有效帮助医生对个体在巴氯芬疗效抵抗性上的了解，进而帮助用药指导。但是，目前仍缺乏快速准确检出GARRB1rs29220突变情况的行之有效的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的引物组合物、试剂盒和方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术的目的之一在于提出了一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的引物组合物，包括多态性检测引物和内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物包括序列如下的引物组分：多态性检测引物一：5′-GGATGGGAAATCAAAGCAG-3′；多态性检测引物二：5′-GATGGGAAATCAAAGCGC-3′；多态性检测引物三：5′-CAGATCCAACTCCACCT-3′；所述内控基因检测引物包括序列如下的引物组分：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。优选的，引物组合物的检测对象为新鲜血液等样本的GABBR1基因。本专利技术的目的之二在于提出了一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包括装有多态性检测引物和内控基因检测引物的试管，其中，所述多态性检测引物包括序列如下的引物组分：多态性检测引物一：5′-GGATGGGAAATCAAAGCAG-3′；多态性检测引物二：5′-GATGGGAAATCAAAGCGC-3′；多态性检测引物三：5′-CAGATCCAACTCCACCT-3′；所述内控基因检测引物包括序列如下的引物组分：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。在一种优选的实施方式中，所述的试剂盒还包括分别采用试管分装的蒸馏水、PCR反应预混液、阳性质控GABBR1基因rs29220突变质粒和阳性质控GABBR1基因rs29220野生质粒。在一种更优选的实施方式中，所述的阳性质控GABBR1基因rs29220突变质粒通过以下方法获得：采用PCR技术，获取GABBR1基因rs29220位点的突变型片段，然后，将突变型片段与pEASY-BluntCloningKit载体连接，转化，再转入大肠杆菌感受态细胞培养，最后，提取质粒，即得到。在一种更优选的实施方式中，所述的阳性质控GABBR1基因rs29220野生质粒通过以下方法获得：采用PCR技术，获取GABBR1基因rs29220位点的野生型片段，然后，将野生型片段与pEASY-BluntCloningKit载体连接，转化，再转入大肠杆菌感受态细胞培养，最后，提取质粒，即得到。在一种更优选的实施方式中，所述的试剂盒采用挡板分隔为两个独立腔体，每个腔体中安装有海绵，在海绵上还加工有用于放置试管的容器孔，所述试剂盒的两个腔体中，其中一个腔体中放置装有蒸馏水与PCR反应预混液的试管，另一个腔体中放置装有各阳性质控质粒、多态性检测引物和内控基因检测引物的试管。在一种更进一步优选的实施方式中，所述的容器孔在试剂盒内平行排列布置。本专利技术在具体检测过程中，即利用ARMS-PCR方法，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计引物(见引物设计)，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。本专利技术的目的之三在于提出了一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的方法，具体涉及GABBR1基因rs29220点突变的检出，具体步骤为：(1)样本处理和核酸提取利用商品化的DNA提取试剂盒处理样本，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNAOD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度应在5～50ng/μL之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议低于5ng/μL者重新进行核酸提取，高于50ng/μL者予以适当稀释至规定的浓度范围，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。试剂盒质控品使用前室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。(2)PCR反应体系的构建：提前30分钟将各试剂取出，室温融化，涡旋振荡10s，2000rpm离心15秒待用，然后，将PCR反应预混液、对应引物和水混合均匀后配制得到对应检测位点的反应混合液，然后将其置于PCR反应管中。(3)然后将已处理样本、阳性质控品和阴性质控品加入PCR反应管中，盖紧管盖(避免气泡产生)，离心后将管壁上液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。(4)设置PCR扩增反应程序，其依次分为预变性、变性和退火、信号采集三个阶段，其中，预变性阶段的温度设置为95℃，处理时间为15min，循环次数为1次，变性阶段为在95℃下处理10s，退火、信号采集阶段则在60℃下保持30s，且变性与信号采集阶段循环40次。(5)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBRGreen染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。与现有技术相比，本专利技术具有以下特点：(1)本专利技术提出了一种用于检测新鲜血液等样本中GABBR1基因突变的具有特异性的引物组合物，其在检测GABBR1基因RS29220突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。(2)本专利技术的试剂盒结构设计简单，使用方便，分区设计使得检测过程不易受污染，检测结果更为精确。(3)检测方法耗时短，敏感性高、特异性强。附图说明图1为本专利技术的试剂盒的结构示意图；图2为本专利技术的检测结果图；图中标记说明：1-盒体，2-海绵，3-挡板，4-装有蒸馏水的试管，5-装有PCR反应预混液的试管，6-装有阳性质控GABBR1基因RS29220突变质粒的试管，7-装有阳性质控GABBR1基因RS29220野生质粒的试管，8-装有内控基因检测引物的试管，9-装有GABBR1基因检测引物的试管，10-容器孔。具体实施方式下面结合附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的引物组合物，其特征在于，包括多态性检测引物和内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物包括序列如下的引物组分：多态性检测引物一：5′‑GGATGGGAAA TCAAAGCAG‑3′；多态性检测引物二：5′‑GATGGGAAAT CAAAGCGC‑3′；多态性检测引物三：5′‑CAGATCCAAC TCCACCT‑3′；所述内控基因检测引物包括序列如下的引物组分：内控引物一：5’‑AGCAAGCAGG AGTATGACG‑3'；内控引物二：5'‑GAAAGGGTGT AACGCAACT‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测的引物组合物，其特征在于，包括多态性检测引物和内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物包括序列如下的引物组分：多态性检测引物一：5′-GGATGGGAAATCAAAGCAG-3′；多态性检测引物二：5′-GATGGGAAATCAAAGCGC-3′；多态性检测引物三：5′-CAGATCCAACTCCACCT-3′；所述内控基因检测引物包括序列如下的引物组分：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。2.一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包括装有多态性检测引物和内控基因检测引物的试管，其中，所述多态性检测引物包括序列如下的引物组分：多态性检测引物一：5′-GGATGGGAAATCAAAGCAG-3′；多态性检测引物二：5′-GATGGGAAATCAAAGCGC-3′；多态性检测引物三：5′-CAGATCCAACTCCACCT-3′；所述内控基因检测引物包括序列如下的引物组分：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。3.根据权利要求2所述的一种巴氯芬药物相关基因GABBR1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括分别采用试管分装的蒸馏水、PCR反应预混液、阳性质控GABBR1基因rs...

【专利技术属性】
技术研发人员：田晓丽，
申请(专利权)人：宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33