一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其应用，本发明专利技术选用棉花纤维作为DNA提取材料，经打碎后在裂解液中裂解，经过多次离心、沉淀，提取得到棉花纤维DNA。该方法操作简单，可快速进行批量DNA提取，耗时少，并以所获得的纤维DNA作为模板，对特定基因进行了常规PCR扩增，结果表明所提取的纤维DNA可满足于常规PCR和SSR分子标记PCR扩增。基于上述特性，通过提取成熟棉纤维DNA，可为棉花重要农艺性状基因的分子标记辅助选择育种提供可行的方法，同时在棉花品种溯源方面研究也具有较好的应用价值。

A rapid method for extracting cotton fiber DNA and its application

The invention discloses a method for rapidly extracting cotton fiber DNA and its application. The cotton fiber is selected as the DNA extracting material, and the cotton fiber DNA is extracted by crushing the cotton fiber and splitting in the cracking solution, and after many times of centrifugation and precipitation. The method was simple, rapid and time-consuming. The obtained fiber DNA was used as a template for routine PCR amplification of specific genes. The results showed that the extracted fiber DNA could be used for routine PCR and SSR molecular marker PCR amplification. Based on the above characteristics, the extraction of mature cotton fiber DNA can provide a feasible method for marker-assisted selection breeding of important agronomic traits genes in cotton, and also has a good application value in traceability of cotton varieties.

【技术实现步骤摘要】
一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其应用。
技术介绍
棉花作为重要的经济作物，棉纤维与人们的生活息息相关。棉纺织品一直以来被列为中国进口商品中的重要项目，目前我国每年进口棉花高达上百万吨，来自世界40多个国家和地区，总货值达上百亿美元。大量进口的棉花虽然缓解了国内供需矛盾，但对国产棉原有市场份额造成冲击，同时进口棉花出现了以次充好、弄虚作假等一系列质量不合格等问题，因此迫切需要一种简便方法来进行棉花品种纯度检测以及产地溯源。目前有多种方法来鉴定棉花品种纯度和真实性，如：小区种植鉴定法、卡那霉素法和DNA分子标记法(周大云等)。DNA分子标记法具有检测速度快、成本低、结果可靠等特点备受人们青睐。简单序列重复SSR(SimpleSequenceRepeats)又称微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)标记，实验操作中对DNA的数量和质量要求不高，即使部分样品有所降解也可进行分析；实验程序简单，操作简便、快速，用时短，不需要使用同位素；扩增产物可靠稳定，重复性好；被认为是目前构建指纹图谱的首选标记，目前已有多种植物以SSR分子标记方法构建了相应的指纹图谱，为品种纯度和真伪性鉴定提供理论依据，也为分子育种过程中亲本的选育提供参考。常规用于棉花分子标记的组织多为种子、叶、茎等组织，很少采用棉花纤维作为供试材料，由于成熟棉纤维含有超过90％的纤维素，且DNA多发生降解，这些都限制着提取的棉纤维DNA的数量和品质。因此开发一种快速提取棉花纤维DNA的方法，且提取的DNA能满足于常规PCR和SSR-PCR扩增，对研究棉花重要农艺性状和棉花品种纯度以及产地溯源具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种快速提取棉花纤维DNA的方法及其在常规PCR扩增和SSR-PCR扩增中的应用，旨在开发以棉花纤维为介质来进行品种纯度鉴定、产地溯源等方面的应用。本专利技术具体通过以下技术方案来实现：一种快速提取棉花纤维DNA的方法，包括以下步骤：1)将棉花纤维充分剪碎后用液氮研磨；2)加入细胞裂解液充分混合，水浴30分钟；3)加入等体积抽提液离心后，取上清加入-20℃预冷异丙醇，缓慢颠倒离心管直至有沉淀析出，-20℃静置20分钟；4)离心弃掉上清液；5)加入70％乙醇水溶液，离心弃掉上清液，重复2～3次；6)加入无水乙醇离心，弃掉废液，室温晾置；7)加入无菌水，4℃保存。进一步，步骤(2)中所述的细胞裂解液为：Tris100mmol/L、EDTA10mmol/L、CTAB20g/L、PVP-3020g/L、Tween2020g/L、NaCl1mol/L、β-巯基乙醇2％(v/v)，调pH至8.0。进一步，步骤(2)中水浴温度保持在65℃。进一步，步骤(3)所述的抽提液为氯仿和异戊醇按照体积比为24:1配置得到。进一步，步骤(3)中预冷异丙醇的添加量为0.6倍体积。进一步，上述所述的离心条件均为：12000rpm，4℃。此外，本专利技术还提供了上述方法在棉花品种分子标记中的应用。本专利技术的有益效果为：利用本专利技术方法可以提取不同发育时期的棉花纤维DNA以及不同年份的皮棉DNA，并以所获得的纤维DNA作为模板，对特定基因进行了常规PCR扩增；以棉花特定SSR引物对棉花纤维DNA进行PCR扩增，建立一种以棉花纤维为介质对棉花品种真实性及品种产地溯源的鉴定体系。该方法可以快速提取棉纤维DNA，利用棉纤维DNA分子标记精准的对棉花品种和原产地进行溯源，对保障我国棉花产业安全和应对国际贸易壁垒具有重要的意义。附图说明图1是不同发育时期的棉花纤维DNA在琼脂糖凝胶上的检测结；其中0DPA、10DPA、15DPA、20DPA、25DPA、30DPA、40DPA分别为开花后不同天数的棉花纤维，0DPA为开花当天胚珠，做阳性对照，Ginnedcotton为皮棉；图2是不同发育时期的棉纤维DNA特定基因PCR扩增结果图；其中GhHis3、GhUBI7、GhEF1分别代表棉花三个不同基因，Negative为阴性对照；图3是不同年份皮棉DNA特定基因PCR扩增结果图；其中2017、2016、2014、2010、2009代表不同年份的皮棉，Negative：阴性对照；图4是棉纤维DNA的SSR引物扩增结果图；其中CS62、NAU1043、NAU1071、NAU1085、NAU1102、NAU1103、NAU1186、NAU1196、NAU1233、NAU1255、NAU1369、NAU2026和NAU2173分别为棉花SSR核心引物，1、2、3分别为棉花品种鲁1127、石抗126和瑞杂816。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。生物材料：本专利技术所涉及的棉花纤维来源于陆地棉TM-1，种子由中国农业科学院棉花研究所提供，材料种植于中国农业科学院棉花研究所露天实验基地，所涉及的皮棉材料由中国农业科学院棉花研究所保存；实验试剂：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、Tris、EDTA、PVP-30、吐温20(Tween20)、NaCl、β-巯基乙醇均购于北京索莱宝生物科技有限公司，Taq酶、电泳MarkerII、Marker2K购于北京全式金生物科技有限公司；引物合成：本专利技术所涉及的引物均有上海生工生物有限公司合成；裂解液配方：Tris100mmol/L、EDTA10mmol/L、CTAB20g/L、PVP-3020g/L、Tween2020g/L、NaCl1mol/L、β-巯基乙醇2％(v/v)，调pH至8.0。实施例1棉花纤维DNA的提取棉花纤维富含纤维素、半纤维素、果胶等物质，细胞壁厚，加大了裂解纤维细胞壁的难度。本专利技术选取棉花纤维和不同年份的皮棉作为研究材料，采用全新裂解液配方取棉纤维DNA，具体过程如下：1)取100-200mg棉花纤维，充分剪碎并液氮研磨。2)加入1.5mL细胞裂解液，充分混匀，65℃水浴30分钟，水浴过程中颠倒离心管数次。3)加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1,V/V)抽提液，缓慢颠倒多次，12000rpm，4℃，离心10分钟。4)取上清转入新的离心管中，加入0.6倍体积-20℃预冷异丙醇，缓慢颠倒离心管直至有沉淀析出，-20℃静置20分钟。5)12000rpm，4℃，离心2分钟，弃掉上清液。6)向离心管中加入600μl70％乙醇水溶液，12000rpm，4℃，离心2分钟，弃掉上清液。7)重复步骤6。8)加入无水乙醇，12000rpm，4℃，离心2分钟，弃掉废液，室温晾置几分钟。9)加入40μl无菌水，4℃保存。实施例2不同发育时期的棉花纤维DNA凝胶电泳检测及常规PCR扩增选取棉花开花后不同发育时期(0DPA、10DPA、15DPA、20DPA、25DPA、30DPA、40DPA、Ginnedcotton)的棉纤维作为供试样品，采用实施例1提取法提取DNA，将所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明0DPA、10DPA、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速提取棉花纤维DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将棉花纤维充分剪碎后用液氮研磨；2)加入细胞裂解液充分混合，水浴30分钟；3)加入等体积抽提液离心后，取上清加入‑20℃预冷异丙醇，缓慢颠倒离心管直至有沉淀析出，‑20℃静置20分钟；4)离心弃掉上清液；5)加入70％乙醇水溶液，离心弃掉上清液，重复2～3次；6)加入无水乙醇离心，弃掉废液，室温晾置；7)加入无菌水，4℃保存。

【技术特征摘要】
1.一种快速提取棉花纤维DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将棉花纤维充分剪碎后用液氮研磨；2)加入细胞裂解液充分混合，水浴30分钟；3)加入等体积抽提液离心后，取上清加入-20℃预冷异丙醇，缓慢颠倒离心管直至有沉淀析出，-20℃静置20分钟；4)离心弃掉上清液；5)加入70％乙醇水溶液，离心弃掉上清液，重复2～3次；6)加入无水乙醇离心，弃掉废液，室温晾置；7)加入无菌水，4℃保存。2.根据权利要求1所述的一种快速提取棉花纤维DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的细胞裂解液为：Tris100mmol/L、EDTA10mmol/L、CTAB20g/L、PVP-3020g/L、Tween2020g...

【专利技术属性】
技术研发人员：马磊，田新权，徐双娇，方丹，时萌，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41