一种植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法技术

本发明专利技术涉及黄曲霉毒素检测分析领域，具体涉及一种植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法。包括下列步骤：取植物蛋白饮料样品，加入含三氯乙酸的甲醇水溶液提取净化液，超声提取、离心，取澄清溶液进行稀释，经免疫亲和柱净化，用高效液相色谱对黄曲霉毒素含量进行测定。本发明专利技术方法可同步检测植物蛋白饮料中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1和G2，准确、快速、安全，抗干扰能力强。检测限为0.05μg/kg，特异性高，重复好，回收率96.00～104.80％。能够满足生产企业、政府检测和监管需求，对保障消费安全具有重大意义。

Detection method of aflatoxin in a vegetable protein beverage

The invention relates to the field of aflatoxin detection and analysis, in particular to a method for detecting aflatoxin in vegetable protein beverages. It includes the following steps: taking the vegetable protein beverage sample, adding the methanol aqueous solution containing trichloroacetic acid to extract and purify, ultrasonic extraction, centrifugation, taking the clarified solution for dilution, purification by immunoaffinity column, and determination of aflatoxin content by high performance liquid chromatography. The method can simultaneously detect aflatoxin M1, B1, B2, G1 and G2 in vegetable protein drinks, and is accurate, fast, safe and has strong anti-interference ability. The detection limit is 0.05 g/kg, the specificity is high, the repetition is good, and the recovery rate is 96 ~ 104.80%. To meet the needs of production enterprises and government inspection and supervision is of great significance for ensuring consumption safety.

【技术实现步骤摘要】
一种植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法
本专利技术涉及黄曲霉毒素检测分析领域，具体涉及一种植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法。
技术介绍
黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是由黄曲霉和寄生曲霉真菌代谢产生的一类有毒的真菌毒素，是人类迄今发现污染农产品毒性最强的一类真菌毒素。植物蛋白饮料主要是以植物果仁、果肉等为主要原料(如大豆、花生、杏仁、核桃仁、椰子、棒子)或添加乳制品调制而成的乳饮料。花生、核桃等植物蛋白饮料的原料在种植、贮藏和加工过程中极易受到黄曲霉毒素污染，由于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2性质稳定，受到污染的原料在加工成饮料后会将毒素带入到成品中；另外，黄曲霉毒素M1是乳及乳制品制品中的主要危害因子，经乳制品调制的植物蛋白饮料，也有可能含有黄曲霉毒素M1毒素。若不采取措施对植物蛋白饮料的黄曲霉毒素污染问题加以监控，植物蛋白饮料中的黄曲霉毒素污染问题必将成为质量安全隐患，严重制约植物蛋白饮料产业快速发展。为保障植物蛋白饮料质量安全和消费安全，需要研究一种植物蛋白饮料中黄曲霉毒素检测技术，以实现快速测定、操作简便、便于在生产企业和政府基层监管机构中推广应用的目的，从而提升生产企业产品质量监控能力及政府基层监管机构监管水平，降低成品污染比例，促进行业健康发展，保障植物蛋白饮料质量安全。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足而提供一种能满足植物蛋白饮料中黄曲霉毒素检测需求、步骤简单、可实现黄曲霉毒素快速检测的方法。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：提供一种植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法，包括如下步骤：取植物蛋白饮料样品，加入含三氯乙酸的甲醇水溶液提取净化液，超声提取、离心，取澄清溶液进行稀释，经免疫亲和柱净化，用高效液相色谱对黄曲霉毒素含量进行测定。按上述方案，所述稀释用溶液为PBS溶液，稀释后溶液过定性滤纸，收集滤液，然后将滤液用黄曲霉毒素免疫亲和柱进行净化浓缩，用甲醇洗脱，收集洗脱液，检测备用；所述的PBS溶液为pH7.4，0.01mol/L的PBS溶液。按上述方案，所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1；黄曲霉毒素含量测定采用的检测方法为柱后光化学衍生高效液相色谱法。按上述方案，所述的超声提取条件为45～60℃，超声时间为5min以上。按上述方案，所述的离心为8000rpm/min离心5min。接上述方案，所述的黄曲霉毒素免疫亲和柱由CNBr活化的琼脂糖凝胶根据需要偶联黄曲霉毒素单克隆抗体于柱管内装填而成，所述的黄曲霉毒素单克隆抗体可根据需要选择由保藏编号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生的黄曲霉毒素通用单克隆抗体、由保藏编号为CCTCCNO.CC201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生的黄曲霉毒素M1单克隆抗体等。按上述方案，所述的提取净化液为三氯乙酸和甲醇水溶液按质量比为0.95:100～1.05:100组成的混合溶液，配制方法：按配比用量将三氯乙酸加入甲醇水溶液，超声溶解得到。按上述方按，甲醇水溶液的浓度为45～55％。按上述方按，所述提取净化液的最佳用量为每克样品加入0.5mL-2.0mL提取净化液。接上述方案，所述的高效液相色谱检测条件为：色谱柱：C184.6×250mm，5μm；柱温：30℃，流动相：45％甲醇水溶液；流速：0.8ml/min；进样量：20μL，激发波长360nm，发射波长440nm。本专利技术的有益效果：本专利技术采用自配提取净化液进行前处理，前处理方法简单，三氟乙酸可以快速沉淀植物蛋白饮料中的蛋白质，降低基质干扰，提高提取效率，降低干扰；通过配合黄曲霉毒素免疫亲和柱分离纯化，可提高黄曲霉毒素检测的特异性和灵敏度，缩短检测时间，黄曲霉毒素组分分离完全，回收率高，适用于植物蛋白饮料的快速定量检测，进而配合高效液相色谱技术进行检测，可同步检测植物蛋白饮料中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1和G2，准确、快速、安全，抗干扰能力强。本专利技术方法的检测限为0.05μg/kg，特异性高，重复好，回收率96.00～104.80％能够满足生产企业、政府检测和监管需求，对保障消费安全具有重大意义。克服了传统检测方法处理繁琐，基质干扰的问题和检测结果不准的缺点。附图说明图1是本专利技术实施例1HPLC分离黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1谱图。图中的纵坐标代表荧光强度，单位为FU，横坐标代表保留时间，单位为分钟。图中1为AFM1、2为AFG2、3为AFG1、4为AFB2、5为AFB1。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1提取浓缩液配制：称取1g±0.01g的三氯乙酸于烧杯中，加入100ml50％的甲醇水，超声溶解，备用。黄曲霉毒素免疫亲和柱由CNBr活化的琼脂糖凝胶4FF偶联由保藏编号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生的黄曲霉毒素单克隆抗体和由保藏编号为CCTCCNO.C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生的黄曲霉毒素M1单克隆抗体于柱管内装填而成。称取20.0g花生蛋白饮料、大豆蛋白饮料、椰子奶蛋白饮料、核桃乳蛋白饮料和杏仁乳蛋白饮料样品，加入10.0ml提取净化液，50℃超声提取5min，8000rpm/min离心5min，取澄清溶液10.0ml，用20.0mlpH7.40.01mol/LPBS溶液稀释，过定性滤纸，收集滤液，取15.0ml样品提取液，用黄曲霉毒素免疫亲和柱浓缩纯化，用甲醇洗脱，用柱后光化学衍生高效液相色谱法检测，检测条件：色谱柱：C184.6×250mm，5μm；柱温：30℃，流动相：45％甲醇水溶液，流速：0.8ml/min；进样量：20μL，激发波长360nm，发射波长440nm。同时配制黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1混合溶液，浓度分别为0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/kg的系列标准溶液，在上述色谱条件下进样测定峰面积，以外标法定量。以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标进行线性回归，结果如表1。表1黄曲霉毒素保留时间、线性方程、检出限及相关系数花生蛋白饮料、大豆蛋白饮料、椰子奶蛋白饮料、核桃乳蛋白饮料和杏仁乳蛋白饮料样品的检测结果见表2。表2不同种类样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1含量注：ND为未检出。实施例2准确称取经确认的阴性花生蛋白样品，分别添加不同浓度的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准工作溶液(具体浓度为：0μg/kg、2.5μg/kg和5μg/kg)，不同浓度的黄曲霉毒素M1标准工作溶液(具体浓度：0μg/kg、0.5μg/kg和1μg/kg)，每个浓度进行5次重复测定。由表3可知，平行样中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1目标物的相对标准偏差为1.01～6.42％，样品的加标回收率在96.00～104.80％。表3花生蛋白饮料添标回收率和相对标准偏差注：ND为未检出。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：取植物蛋白饮料样品，加入含三氯乙酸的甲醇水溶液提取净化液，超声提取、离心，取澄清溶液进行稀释，经免疫亲和柱净化，用高效液相色谱对黄曲霉毒素含量进行测定。

【技术特征摘要】
1.一种植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：取植物蛋白饮料样品，加入含三氯乙酸的甲醇水溶液提取净化液，超声提取、离心，取澄清溶液进行稀释，经免疫亲和柱净化，用高效液相色谱对黄曲霉毒素含量进行测定。2.根据权利要求1所述的植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于：所述稀释用溶液为PBS溶液，稀释后溶液过定性滤纸，收集滤液，然后将滤液用黄曲霉毒素免疫亲和柱进行净化浓缩，用甲醇洗脱，收集洗脱液，检测备用。3.根据权利要求1所述的植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于：所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1；黄曲霉毒素含量测定采用的检测方法为柱后光化学衍生高效液相色谱法。4.根据权利要求1所述的植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于：所述的超声提取条件为45～60℃，超声时间为5min以上。5.根据权利要求1所述的植物蛋白饮料中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于：所述的离心为8000rpm/min离心5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张奇，王督，张莉，范志勇，张兆威，李培武，余婷婷，江丰，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，湖北省食品质量安全监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：湖北,42