本发明专利技术提供一种应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液，所述封闭液包括如下按重量份计组分：脱脂奶粉40‑50份；氯化钠7‑10份；氯化钾0.1‑0.3份；磷酸氢二钠1.0‑2.0份；磷酸二氢钾0.2‑0.4份；蒸馏水1000份；所述封闭液封闭时间为15‑40min，封闭温度为32～35℃。本发明专利技术封闭液既能封闭非特异性背景染色，且不会造成过度封闭导致的显影信号变弱。相比较常用的BSA、酪蛋白、动物非免疫血清等免疫组化封闭液，本发明专利技术的封闭液封闭效果更好，且成本较低，同时也没有感染动物病毒的风险。
A closed liquid used for immunocytochemistry P16 protein staining and its preparation method
The present invention provides a blocking solution for immunocytochemical P16 protein staining. The blocking solution comprises the following components by weight: skimmed milk powder 40 to 50 parts; sodium chloride 7 to 10 parts; potassium chloride 0.1 to 0.3 parts; disodium hydrogen phosphate 1.0 to 2.0 parts; potassium dihydrogen phosphate 0.2 to 0.4 parts; distilled water 1000 parts; the blocking solution is sealed by weight. The time is 15 40min and the sealing temperature is 32~35 C. The sealing solution of the invention can block the non-specific background dyeing and does not cause the development signal weakening caused by the excessive sealing. Compared with the commonly used BSA, casein, animal non-immune serum and other immunohistochemical sealants, the sealant has better sealing effect, lower cost and no risk of infection with animal virus.
【技术实现步骤摘要】
一种应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液及其制备方法
本专利技术属于临床医学病理
，具体涉及一种应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液及其制备方法。
技术介绍
宫颈癌是妇科最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌，位居女性恶性肿瘤第二位，严重威胁女性的身体健康和生活质量。中国是宫颈癌的高发国家，发生率及死亡率约占全世界的1/3。宫颈癌也是目前唯一病因明确，通过有效的早期诊断及治疗可以完全治愈的癌症。当前，宫颈癌筛查普遍使用液基细胞学，液基细胞学特异性高约90％，但灵敏度不足，约50％，造成了约一半患者漏检。为弥补液基细胞学不足，临床应用HPV基因检测作为辅助技术，HPV基因检测灵敏度较高约90％，但特异性不足10％，易造成过度医疗和医疗资源的浪费。2012年美国、2014年世卫组织确认P16为宫颈癌唯一生物标志物。宫颈脱落细胞免疫细胞化学P16蛋白染色对比液基细胞学和HPV基因检测，具有90％以上的灵敏度，且特异性较高约85％，临床意义明确。在免疫组织化学反应中，抗体能够识别抗原决定簇，然后与之特异性结合。封闭液作用原理主要是通过蛋白非特异性地与表面的抗原决定簇结合，导致特异性的抗体不能跟这些非特异性的抗原决定簇结合，染色背景就会降低。而目标抗原决定簇与抗体结合非常特异，结合能力很强，封闭之后依然能够结合。但如果封闭液封闭时间太长或浓度过高，也会影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱。免疫组织化学常用的封闭液有血清、酪蛋白等，如专利CN104990781A采用山羊血清作为封闭液，37℃孵育10分钟；专利CN203350254U采用即用型BSA封闭液，室温孵育1小时或4℃过夜；专利CN102183651A采用动物血清、白蛋白等作为封闭液，37℃孵育40分钟。在免疫细胞化学反应中，封闭液的作用原理和免疫组织化学相同，然而细胞片和组织片的不同使得免疫组织化学常用的封闭液和封闭时间不适合直接用于免疫细胞化学，如专利CN102565393A公开的免疫细胞化学染色试剂盒采用BSA、胎牛血清来制备封闭液，文中并没有提及封闭液的封闭效果，而事实上所述封闭液极易导致封闭不完全的非特异性背景染色，或封闭过度的显影信号变弱。专利CN105241726A公开了封闭液组分为脱脂奶粉45-55g、磷酸二氢钾0.25-0.29g、磷酸氢二钠1.32-1.52g、氯化钠7-9g、氯化钾0.15-0.25g、蒸馏水1L，但文件中并没有公开封闭液的封闭时间和温度，更没有提及封闭液的封闭效果。目前，国内P16蛋白免疫细胞化学染色处于应用初期，探索一种适合的封闭液对该技术的推广应用起着非常重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液，所述封闭液能完全封闭非特异性背景染色，且不会造成过度封闭导致的显影信号变弱，保证最佳的封闭效果。本专利技术的另一目的在于提供所述应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液的制备方法。本专利技术的上述目的通过以下技术方案予以实现：一种应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液，所述封闭液包括如下按重量份计组分：脱脂奶粉40-50份；氯化钠7-10份；氯化钾0.1-0.3份；磷酸氢二钠1.0-2.0份；磷酸二氢钾0.2-0.4份；蒸馏水1000份；所述封闭液封闭时间为15-40min，封闭温度为32～35℃。专利技术人不断研究发现，在封闭液的配方中脱脂奶粉的含量在40-50g时，封闭效果最优；脱脂奶粉含量低于40g时，封闭率明显下降；脱脂奶粉含量高于50g时，封闭率虽然很高，但已出现阳性减弱现象。而封闭液的封闭时间在15-40min时封闭效果好，既能封闭非特异性背景染色，且不会造成过度封闭导致的显影信号变弱。相比较常用的BSA、酪蛋白、动物非免疫血清等免疫组化封闭液，本专利技术的封闭液封闭效果更好，成本低，且没有感染动物病毒的风险。优选地，所述封闭液包括如下按重量份计组分：脱脂奶粉45-50份；氯化钠7-8份；氯化钾0.15-0.25份；磷酸氢二钠1.32-1.52份；磷酸二氢钾0.25-0.29份；蒸馏水1000份。优选地，所述封闭液封闭时间为25-40min，封闭温度为32～35℃。封闭时间为25-40min时，封闭液的封闭效果更佳。优选地，所述封闭液还包括按重量份计硫酸庆大霉素0.01-0.02份、吐温200.5-1份。优选地，所述封闭液还包括按重量份计白蛋白15-20份。优选地，所述封闭液还包括按重量份计胰蛋白胨10-12份。本专利技术所述应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液的制备方法，包括如下步骤：S1.称量配方量的氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，依次溶于蒸馏水中；S2.再加入脱脂奶粉，脱脂奶粉分3次加入，边加入边搅拌使其溶解均匀，过夜；S3.过滤，密封保存。优选地，S3采用中速滤纸过滤，所得滤液在2-8℃密封保存。所述封闭液在免疫细胞化学P16染色中的应用。本专利技术的有益效果：1.相比较BSA、酪蛋白、动物非免疫血清等免疫组化封闭液，本专利技术的封闭液封闭效果更好，且成本较低；2.相比较BSA、动物非免疫血清等封闭液，没有感染动物病毒的风险。附图说明图1为实施例1染色结果中重度非特异性背景染色图；图2为实施例1染色结果中中度非特异性背景染色图；图3为实施例1染色结果中轻度非特异性背景染色图；图4为实施例1染色结果中无非特异性背景染色图；图5为阳性对照的阳性显色图；图6为阳性对照的阳性减弱及显示阴性图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合说明书附图和实施例，对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术要求的保护范围并不局限于实施例。下述实施例采用的试剂规格为：氯化钠(AR)，氯化钾(AR)、磷酸氢二钠(AR)、磷酸二氢钾(AR)、蒸馏水(双蒸水)、硫酸庆大霉素(USP级)、胰蛋白胨(BR级)、白蛋白(来源于鸡蛋白、生物技术级)。实施例1:用电子分析天平秤取氯化钠7g、氯化钾0.15g、磷酸氢二钠1.32g、磷酸二氢钾0.25g，依次溶于1L的蒸馏水中，溶解完全后，加入脱脂奶粉45g，脱脂奶粉分3次加入，边加入边搅拌使其溶解均匀，常温过夜后，用中速滤纸过滤，2-8℃密封保存待用。实施例2:用电子分析天平秤取氯化钠8g、氯化钾0.25g、磷酸氢二钠1.52g、磷酸二氢钾0.29g，依次溶于1L的蒸馏水中，溶解完全后，加入脱脂奶粉50g，脱脂奶粉分3次加入，边加入边搅拌使其溶解均匀，常温过夜后，用中速滤纸过滤，2-8℃密封保存待用。实施例3:用电子分析天平秤取氯化钠7g、氯化钾0.1g、磷酸氢二钠1.0g、磷酸二氢钾0.20g，依次溶于1L的蒸馏水中，溶解完全后，加入脱脂奶粉40g，脱脂奶粉分3次加入，边加入边搅拌使其溶解均匀，然后加入酸庆大霉素0.01g，吐温200.5ml，常温过夜后，用中速滤纸过滤，2-8℃密封保存待用。实施例4:用电子分析天平秤取氯化钠10g、氯化钾0.3g、磷酸氢二钠2.0g、磷酸二氢钾0.4g，依次溶于1L的蒸馏水中，溶解完全后，加入脱脂奶粉50g，脱脂奶粉分3次加入，边加入边搅拌使其溶解均匀，然后加入酸庆大霉素0.02g，吐温201.0g，常温过夜后，用中速滤纸过滤，2-8℃密封保存待用。实施例5:用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液，其特征在于，所述封闭液包括如下按重量份计组分：脱脂奶粉 40‑50份；氯化钠 7‑10份；氯化钾 0.1‑0.3份；磷酸氢二钠 1.0‑2.0份；磷酸二氢钾 0.2‑0.4份；蒸馏水 1000份；所述封闭液封闭时间为15‑40min，封闭温度为32～35℃。
【技术特征摘要】
1.一种应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液，其特征在于，所述封闭液包括如下按重量份计组分：脱脂奶粉40-50份；氯化钠7-10份；氯化钾0.1-0.3份；磷酸氢二钠1.0-2.0份；磷酸二氢钾0.2-0.4份；蒸馏水1000份；所述封闭液封闭时间为15-40min，封闭温度为32～35℃。2.根据权利要求1所述应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液，其特征在于，所述封闭液包括如下按重量份计组分：脱脂奶粉45-50份；氯化钠7-8份；氯化钾0.15-0.25份；磷酸氢二钠1.32-1.52份；磷酸二氢钾0.25-0.29份；蒸馏水1000份。3.根据权利要求1或2所述应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封闭液，其特征在于，所述封闭液封闭时间为25-40min，封闭温度为32～35℃。4.根据权利要求1或2所述应用于免疫细胞化学P16蛋白染色的封...
【专利技术属性】
技术研发人员：李小梅，骆伟明，李飞，申令，李高峰，李芳，
申请(专利权)人：广州江元医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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