一种细胞固定保存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种细胞固定保存液及其制备方法和应用，所述细胞固定保存液按重量百分数计由1％-5％磷酸盐、30％-70％脂肪醇或多元醇、5％-10％有机胺盐、0.5％-1％抗生素和15％-60％水组成。本发明专利技术提供的细胞固定保存液在不含有醛类化合物的情况下仍保持细胞活性，对细胞进行保存固定，避免细胞中氨基酸与醛类物质结合而使蛋白质结构被破坏而使得抗原蛋白不能有效被抗体识别，在进行免疫化学染色实验前无需再使用高温高压设备进行抗原修复，简化了实验步骤，也避免因使用高温高压的仪器设备带来的实验风险高，结果不稳定的问题，使整个化学染色实验更加简便、稳定与安全。稳定与安全。稳定与安全。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞固定保存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及临床医学
，特别涉及一种细胞固定保存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]对于液基脱落的细胞的免疫组化过程，需要将细胞放置于细胞固定固定保存液，免疫组化是临床诊断和组织病理学中常用的检测手段，抗原修复是免疫组化过程中不可忽略的关键步骤。在免疫组化过程中，常采用的固定液含有福尔马林，福尔马林的主要成分是甲醛，可用于保存细胞形态，稳定细胞基质，防止细胞发生自噬或蛋白移位。福尔马林中的甲醛可以特定地结合到某些氨基酸残基上，比如赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等。在这个反应中，组织上的活性氢首先与甲醛发生反应得到羟甲基，羟甲基再与其他的活性氢发生反应最终得到交联的蛋白。因为这一过程消耗了氨基中的氢，所以扰乱了氨基酸之间原有的氢键和相互作用，使蛋白质的三级或四级结构被破坏从而导致抗原不能很好的被抗体识别，从而影响了免疫细胞抗体识别效果。为此，使用含有福尔马林的细胞固定液固定固定保存液的免疫细胞化学染色还普遍需要使用高温、高压或化学试剂进行抗原修复，这样会导致免疫细胞化学染色实验步骤复杂繁琐，结果不稳定以及实验风险大。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种细胞固定保存液，液基脱落细胞样本取材后，放置于该细胞固定固定保存液中，在进行后续细胞化学染色实验前无需再使用高温高压设备或化学试剂进行抗原修复，简化了实验步骤，也避免因使用高温高压的仪器设备带来的实验风险高，结果不稳定的问题，使整个化学染色实验更加简便、稳定与安全。
[0004]本专利技术的另一个目的在于提供上述细胞固定保存液在免疫细胞染色中的应用。
[0005]本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的：
[0006]本专利技术提供一种细胞的固定保存液，由磷酸盐、脂肪醇或多元醇、有机胺盐、抗生素和水组成，各组分按重量百分数计为：
[0007]水：15％-60％；
[0008]磷酸盐:1％-5％；
[0009]脂肪醇或多元醇：30％-70％；
[0010]有机胺盐：5％-10％；
[0011]抗生素：0.5％-1％。
[0012]本专利技术提供的细胞固定保存液，由磷酸盐、脂肪醇或多元醇、有机铵盐和抗生素组成，能够在保持PH值稳定情况下，为细胞提供生长和存活所需要的盐离子和氨基酸等成分，保持细胞活性，且加入的抗生素可加强细胞保存固定液所固定的细胞抗感染能力，且本发
明细胞保存液不含有传统细胞固定保存液的中的福尔马林等醛类物质，可以避免传统细胞固定保存液的福尔马林等醛类化合物特定地结合到某些氨基酸残基上，最终形成交联蛋白，使蛋白质的三级或四级结构被破坏从而导致抗原不能很好的被抗体识别，在进行免疫细胞染色前无需进行高温抗原修复，简化了实验步骤，也避免因使用高温高压的仪器设备带来的实验风险高，结果不稳定的问题。
[0013]进一步地，所述细胞固定保存液各组分按重量百分数计为：
[0014]水：30％-40％；
[0015]磷酸盐：1％-4％；
[0016]脂肪醇或多元醇：35％-60％；
[0017]有机铵盐：8％-10％；
[0018]抗生素：1％。
[0019]进一步地，所述磷酸盐包括正磷酸盐、缩聚磷酸盐中一种或两种混合，加入磷酸盐可调节保存固定液的ph值，使得保存液呈弱酸性，在脱落细胞进入弱酸性的液基薄层保存液中时，脱落细胞所处的环境pH不会变化较大，不会从酸性环境直接过渡到碱性环境，避免细胞在固定时pH发生较大变化而破裂，进一步提高细胞固定的完整性和可靠性。而且，加入磷酸盐，不仅能维持pH值的稳定，而且能较长时间满足细胞良好生长所需的CO2浓度。
[0020]进一步地，所述脂肪醇包括甲醇、乙醇中的一种或两种混合；所述多元醇包括丙三醇、1,2,4-丁三醇、三羟甲基丙烷、季戊四醇中的一种或两种以上混合，通过醇类物质使得细胞低温保存时防止液基细胞保存液内的水分结冰。
[0021]进一步地，所述有机胺盐包括二氨基胍盐酸盐、2,4,5,6-四氨基嘧啶盐酸盐、氨基乙腈盐酸盐、6-硝基苯并咪唑硝酸盐一种或两种混合，加入有机铵盐，为细胞提供生长和存活所需要的盐离子和氨基酸等成分，保持细胞活性。
[0022]进一步地，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类一种或两种混合，通过加入所述抗生素，使得细胞保存固定液所固定的细胞抗感染能力强。
[0023]本专利技术提供的细胞固定保存液的制备方法包含以下步骤：
[0024](1)将磷酸盐和有机胺盐按照配方比例配好混合，加水进行溶解，制得第一混合溶液；
[0025](2)往第一混合溶液再加入脂肪醇或多元醇，混合均匀，制得第二混合溶液；
[0026](3)往第二溶液中加入抗生素，混合均匀，获得细胞固定保存液。
[0027]进一步地，本专利技术的细胞固定保存液可应用于细胞化学染色实验。
[0028]所述细胞化学染色实验包含以下步骤：
[0029](31)用磷酸缓冲液冲洗载玻片；
[0030](32)在载玻片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂，如H2O2,室温下孵育10min-20min；
[0031](33)再次用磷酸缓冲液冲洗载玻片；
[0032](34)在载玻片上滴加封闭液，在室温下孵育10min-20min；
[0033](35)在载玻片上滴加一抗稀释液，采用32℃恒温水浴30min-60min；
[0034](36)再次用磷酸缓冲液冲洗；
[0035](37)在载玻片上滴加二抗溶液，采用32℃恒温水浴10min-20min；
[0036](38)再次用磷酸缓冲液冲洗载玻片；
[0037](39)在载玻片上滴加显色液，如DAB显色液。
[0038]本专利技术所提供的细胞固定保存液不含有福尔马林等醛类化合物，所保存固定的液基脱落细胞的化学染色实验可不经过高温的抗原修复仍可取得良好的染色效果，使得整个实验过程高效快捷，同时由于不含醛类化合物有毒物质，也降低了化学染色实验的风险。
[0039]本专利技术相对于现有技术所具有的优点及有益效果：
[0040](1)本专利技术提供的细胞保存固定液，对液基脱落细胞样本取材后进行保存固定，用于后续细胞化学染色实验，固定液不包含福尔马林等醛类化合物，仍能维持pH值的稳定，为细胞提供生长所需的CO2浓度，很好的维持细胞活性，防止细胞感染，固定保存细胞，避免醛类物质特定地结合到某些氨基酸残基上形成交联蛋白，使蛋白质的三级或四级结构被破坏从而导致抗原不能很好的被抗体识别，需进行高温抗原修复才可进行后续化学染色实验，本专利技术提供的细胞保存固定液则无需再使用高温、高压或化学试剂进行抗原修复仍能达到良好的化学染色效果，简化了实验步骤，也避免因使用高温高压的仪器设备带来的实验风险高，结果不稳定的问题，从而使整个免疫细胞化学染色更加简便、稳定与安全。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞固定保存液，其特征在于，由磷酸盐、脂肪醇或多元醇、有机胺盐、抗生素和水组成，各组分按重量百分数计为：水：15％-60％；磷酸盐:1％-5％；脂肪醇或多元醇：30％-70％；有机胺盐：5％-10％；抗生素：0.5％-1％。2.根据权利要求1所述的细胞固定保存液，其特征在于，所述细胞固定保存液各组分按重量百分数计为：水：30％-40％；磷酸盐：1％-4％；脂肪醇或多元醇：35％-60％；有机铵盐：8％-10％；抗生素：1％。3.根据权利要求1所述的细胞固定保存液，其特征在于，所述磷酸盐包括正磷酸盐、缩聚磷酸盐中一种或两种混合。4.根据权利要求1所述的细胞固定保存液，其特征在于，所述脂肪醇包括甲醇、乙醇中的一种或两种混合；所述多元醇包括丙三醇、1,2,4-丁三醇、三羟甲基丙烷、季戊四醇中的一种或两种以上混合。5.根据权利要求1所述的细胞保存固定液，其特征在于，所述有机胺盐包括二氨基胍盐酸盐、2,4,5,6-四氨基嘧啶盐酸盐、氨基乙腈盐酸盐、6-硝基苯并咪唑硝酸盐中的一种或两种以上混合。6.根据权利要求1所述的细胞固定保存液，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类中的一种或两种以上混合。7.一种权利要求1所述的细胞固定保存液的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏仲春，段天雄，
申请(专利权)人：广州江元医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：