一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法、细胞悬液及应用该方法的化学染色方法技术

本发明专利技术提供一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法，包括如下步骤:采集细胞样本的步骤；加入样本密度分离液的步骤，将细胞样本转移至离心管中，往离心管中加入样本密度分离液，并加入30％～70％的乙酸盐溶液，两者体积比为1:1～3:1；重力离心操作步骤，完毕后，弃去上层废液，得到含有样本细胞的沉淀物；制备细胞悬液步骤，往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入缓冲液，将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。本发明专利技术创新性地在分层离心步骤前在样本密度分离液中加入乙酸盐溶液，有效溶解样本的粘液，更好地打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，达到抗原修复作用，致使化学双染色及多染色效果明显。

【技术实现步骤摘要】
一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法、细胞悬液及应用该方法的化学染色方法
本专利技术涉及医学生物
，具体涉及一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法、细胞悬液，以及应用该方法的化学染色方法。
技术介绍
免疫细胞化学染色技术(ICC)是细胞化学技术和免疫学技术相结合的一种检测技术，是以抗原和抗体特异性识别为基础，结合特定的化学显色物质或荧光物质，特异性地检测细胞内或膜表面的多肽、蛋白质等的存在和分布。免疫细胞化学染色技术在病理诊断中是一项重要的参考，被广泛应用于诊断与鉴别诊断中。P16基因是一种细胞的周期素依赖性激酶(CDK)抑制剂，由于与多种肿瘤有关被称为多肿瘤抑制基因，其基因产物对CDK4的活性有抑制作用，也称为p16INK4。细胞处于细胞周期的阻滞期，p16蛋白会过度表达。一过性的HPV感染不会影响细胞周期的调控，而持续性HPV感染的细胞的异常增生，会导致p16过表达，因此p16过表达可作为宫颈高级别病变的特异性标志物。Ki-67则是一种标志着细胞周期进展及增殖期细胞的核抗原基因，其表达仅限于细胞增殖周期的G1、S、G2期和M期，且在G0期表达缺失。处于细胞周期的增殖期时的细胞会过度表达Ki-67。通常生理机能正常的细胞，p16和Ki-67的同时过表达是不会出现的。如果，p16和Ki-67同时过度表达，则提示细胞周期调控失调。因此，在同一细胞中同时用免疫细胞化学染色技术方法检测p16和Ki-67可作为细胞周期失调的标志物。免疫细胞化学染色是一项由多步骤组成的实验技术，具体为:细胞固定、切片制备、抗原修复、抗原抗体反应、目标抗原显色等。免疫细胞化学染色技术的染色质量及效果受多种因素影响，在众多因素中抗原修复这一步骤最为重要，因为不恰当的抗原修复可能导致假阴性结果。原因是细胞固定液会封闭细胞的抗原决定簇的表达，所以在切片制备完成后需要进行抗原修复。细胞固定液在固定标本期间，能有效增加组织内的蛋白质分子交联，抗原被封闭，在一定程度上能够对免疫细胞化学染色结果产生影响。加剧抗原性物质分子运动是广泛接受热修复抗原的主要因素，从而打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，暴露抗原，实现抗原修复效果。目前，抗原修复常用的方法有酶修复法和热修复法。相比热修复法的抗原免疫细胞染色效果，酶消化法修复相对较差。现有技术提供一种密度梯度分层离心法，其不需要高温高压的条件，同样能实现抗原修复的效果，密度梯度分层离心法也属于物理方法，可能在打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联起到洗脱细胞固定液的效果，从而暴露抗原，达到抗原修复的作用。但其在应用于双染色(DAB染色系统和AP-RED染色系统)的免疫细胞化学染色的时候发现染色效果并不理想，特别是AP-RED染色发现出现染色效果差、染色不准确(非特异性)的情况。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法，在密度梯度分层离心法之前加入含有乙酸钠溶液的样本密度分离液，达到抗原修复的效果，在免疫细胞化学双染色以及多重染色实验中均能显色。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法，其特征在于包括如下步骤：采集细胞样本的步骤；加入样本密度分离液的步骤：将细胞样本转移至离心管中，，往离心管中加入样本密度分离液，并加入30％～70％的乙酸盐溶液，所述样本密度分离液与所述乙酸盐溶液体积比为1:1～3:1；重力离心步骤：加入所述样本密度分离液后在800g～1500g离心力作用下离心5min～10min，完毕后，弃去上层废液，得到含有细胞样本的沉淀物；制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入缓冲液，用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。本技术方案在重力离心步骤前加入含有乙酸离子的溶液，能有效溶解样本的粘液，使样本干净、无粘液，再在这个基础上进行密度梯度分层离心法，能够很好地打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，起到洗脱细胞固定液的效果，从而暴露抗原，达到抗原修复的作用，能使双染色及多染色达到染色理想的效果。进一步地，所述乙酸盐溶液浓度为30％-50％。进一步地，所述乙酸盐溶液为乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、乙酸锌溶液中的一种或多种，所述样本密度分离液与所述乙酸盐溶液体积比为3:1，其中的乙酸离子能够起到溶解细胞样本粘液，使得样本干净无粘液，在此基础上采用密度梯度分层离心法，更好达到抗原修复作用，使得化学双染色效果更好，显色明显。进一步地，所述样本密度分离液是丙三醇与乙醇的混合溶液，丙三醇与乙醇的体积比为(1-2):(2-1)，所述样本密度分离液与细胞样本的体积比为(3-7):(7-3)，所述细胞沉淀物与缓冲液的体积比为1:1。样本细胞可优选为宫颈细胞。丙三醇的质量较大，可吸附质量较大的细胞样本沉积。进一步地，所述重力离心步骤分两次进行，加入所述样本密度分离液后先进行微重力离心步骤，再进行重力离心步骤，所述微重力离心步骤为：离心管在150g～200g离心力作用下离心1min～5min，完毕后将上层液体吸走。由于丙三醇的质量较大，可吸附质量较大的细胞样本沉积，而对于中等以及小质量的样本细胞，则需通过两次离心以及离心力和离心时间的调控，将其充分分离，以得到高纯度的细胞样本沉淀。本专利技术还提供采用以上步骤制得的细胞悬液，并将该细胞悬液用于免疫细胞化学双染色及多染色实验中。本专利技术还提供一种免疫细胞染色方法，包括如下步骤：将上述获得的细胞悬液滴加到制片仓的载玻片上静止沉降，完成制片；将上述载玻片用磷酸缓冲液冲洗，然后滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育；再用磷酸缓冲液冲洗，之后滴加封闭液，室温下孵育；继续滴加稀释后的一抗溶液，32℃恒温水浴30～60min；然后用磷酸缓冲液冲洗，再滴加二抗溶液，32℃恒温水浴10～20min；再用磷酸缓冲液冲洗；最后滴加DAB显色液，再用磷酸缓冲液冲洗后，滴加AP-RED显色液。其中DAB显色液为预先制备好的DAB显色A系统，AP-RED显色液为预先配置好的AP-RED显色B系统。进一步地，所述静止沉降时间为10min，所述磷酸缓冲液步骤需进行3次，每次1～2分钟；所述室温下孵育时间为10～20min。进一步地，所述一抗溶液为鼠源抗P16抗体和兔源抗Ki-67抗体的混合溶液，所述二抗溶液为羊抗鼠HRP二抗和羊抗兔AP二抗混合溶液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：密度梯度分层离心法打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联起到洗脱细胞固定液的效果上起到增强，从而暴露抗原，达到抗原修复的作用，但脱落细胞绝大多数样本具有粘液，在进行化学双染色的情况下，因为涉及到多抗体，多染色，所以密度梯度分层离心法的要求更高，需要比较干净、无粘液的环境，具有粘液会增加样本的粘度，使得离心比较难打破封闭的抗原决定簇的蛋白质分子与化学键间的交联，化学双染色以及多染色的要求高使得该问题本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法，其特征在于包括如下步骤，/n采集细胞样本的步骤；/n加入样本密度分离液的步骤：将细胞样本转移至离心管中，往离心管中加入样本密度分离液，并加入30％～70％质量浓度的乙酸盐溶液，所述样本密度分离液与所述乙酸盐溶液体积比为1:1～3:1；/n重力离心步骤：加入所述样本密度分离液后在800g～1500g离心力作用下离心5min～10min，完毕后，弃去上层废液，得到含有细胞样本的沉淀物；/n制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入缓冲液，将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于免疫细胞化学染色的抗原修复方法，其特征在于包括如下步骤，
采集细胞样本的步骤；
加入样本密度分离液的步骤：将细胞样本转移至离心管中，往离心管中加入样本密度分离液，并加入30％～70％质量浓度的乙酸盐溶液，所述样本密度分离液与所述乙酸盐溶液体积比为1:1～3:1；
重力离心步骤：加入所述样本密度分离液后在800g～1500g离心力作用下离心5min～10min，完毕后，弃去上层废液，得到含有细胞样本的沉淀物；
制备细胞悬液步骤：往含有细胞样本的沉淀物的离心管中加入缓冲液，将离心管底部的细胞打散，制成细胞悬液。


2.根据权利要求1所述的抗原修复方法，其特征在于，所述乙酸盐溶液质量浓度为30％-50％。


3.根据权利要求1所述的抗原修复方法，其特征在于，所述乙酸盐溶液为乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、乙酸锌溶液中的一种或多种，所述样本密度分离液与所述乙酸盐溶液体积比为3:1。


4.根据权利要求1所述的抗原修复方法，其特征在于，所述样本密度分离液为丙三醇与乙醇混合液，所述丙三醇与所述乙醇的体积比为(1-2):(2-1)，所述样本密度分离液与所述细胞样本的体积比为(3-7):(7-3)，所述细胞沉淀物与缓冲液的体积比为1:1。


5.根据权利要求1所述的抗原修复方法，其特征在于，所述重力离心步骤分两次进行，先进行微重力离心步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏仲春，
申请(专利权)人：广州江元医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44