本发明专利技术涉及一种实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法，其实时荧光PCR真菌检测引物，所述引物包括：上游引物ITSF1和下游引物ITSR1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1‑2所示。本发明专利技术的实时荧光PCR真菌检测试剂盒具有能实现三类真菌的区分检测及念珠菌的种鉴定的优点。
Real time fluorescent PCR for detection of primers, probes, kits and detection methods
The invention relates to a real-time fluorescent PCR fungal detection primer, probe, reagent kit and detection method. The real-time fluorescent PCR fungal detection primer comprises an upstream primer ITSF1 and a downstream primer ITSR1, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID No.1_2. The real-time fluorescent PCR fungal detection kit of the invention has the advantages of realizing the distinguishing detection of three kinds of fungi and the species identification of candida.
【技术实现步骤摘要】
实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及微生物检测技术，特别涉及一种实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法
技术介绍
近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗恶性肿瘤药物的广泛应用，以及器官移植、各种侵入性诊疗技术的深入开展，致病真菌感染日益增多。致病真菌主要包括念珠菌、曲霉菌、隐球菌、接合菌等。研究认为，念珠菌、曲霉菌、肺孢子菌和隐球菌是最主要的致病真菌感染病原菌，其中念珠菌居首。全世界每年约1.4million患者因为这四种致病真菌感染死亡，而真菌病中，90％致死率的真菌为隐球菌、念珠菌、曲霉菌和肺孢子菌。据统计数据显示，2014年共收集3310株致病真菌菌株，91.4％为念珠菌、隐球菌6.3％、毛孢子菌1.0％、其他菌属1.3％。其中念珠菌中白念念珠菌占比41.4％、热带念珠菌占比15％、近平滑念珠菌占比16.9％、光滑念珠菌9.3％、季也蒙念珠菌2.6％、克柔念珠菌1.3％。目前，致病真菌感染的流行病学特征已发生改变，白色念珠菌曾是念珠菌感染的主要菌种类型，然而研究认为，近年来光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等其他念珠菌的感染率也在逐渐上升；北美及欧洲的许多中心调查显示，以往不常见的真菌，如隐球菌属、镰刀菌属等，现在其发病率也有所提高，尤其隐球菌属发病率仅次于念珠菌属和曲霉菌属。然而，目前对致病真菌的检测主要还是依赖传统的检测方法，包括培养法、显微镜检查、酶联免疫、血清培养、免疫学等，但是这些方法一般耗时长、敏感性差，而且容易出现假阳性或假阴性结果。再者，培养过程中真菌会在感染部位迅速增殖，等到培养结果出来之前可能就会发生很严重的后果，容易延误病情的诊断与及时预防治疗。另外，大多数学者利用真菌通用引物ITS4和ITS86检测rRNA基因的ITSII序列，可以将致病真菌鉴定到属，但该方法需要借助于测序来鉴定真菌的种类，耗时较长，不利于致病真菌感染的早期诊断。鲁卫平等采用构建通用引物的一次PCR法，并结合纳米金新型基因芯片检测系统，实现了一次对多个临床常见致病酵母菌的检测分析，但是生物芯片技术存在着成本高、复杂、灵敏度低、重复性差等缺点，限制了生物芯片的广泛应用。近年来，质谱技术以其快速准确的优点被用于微生物鉴定，由于质谱鉴定必须是培养后分纯的单克隆菌落，而且设备昂贵，操作难度高等限制了其应用。实时荧光PCR技术作为一种新兴的检测手段，具有敏感性好、重复性好、避免PCR污染、检测时间短、自动化程度高、线性范围宽等优点，逐渐被应用到病原性真菌检测中。郭强等采用实时荧光定量PCR，建立了快速鉴定白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌的方法，以真菌通用引物ITS4、ITS86为检测引物，最低检测下限达到1-5CFU/mL，可同时检测5种念珠菌。鲁巧云等采用基于TaqMan水解探针的实时荧光定量PCR的方法，建立了真菌通用检测体系、念珠菌检测体系、曲霉检测体系，以血清为标本可将临床常见的曲霉和念珠菌鉴定到属的水平。韩学贞等采用荧光定量PCR染料结合法检测致病真菌，建立的检测体系可检测念珠菌属、曲霉菌属、新型隐球菌。目前，CN201110417477.6专利公开了一种通过分子信标探针来检测白色念珠菌的试剂盒；CN201410017428.7专利公开了一种提供核酸释放剂和检测白色念珠菌的试剂盒；CN200910098559.1专利公开了一种荧光定量PCR检测肠道近平滑念珠菌的试剂盒；CN200910098556.8和CN201610589461.6专利分别公开了一种荧光定量PCR检测克柔念珠菌的试剂盒；CN201510011617.8专利公开了一种检测光滑念珠菌的试剂盒；CN201410017251.0、CN201710172567.0和CN201310206320.8专利公开了一种检测隐球菌的试剂盒。以上几篇专利均是单一菌种检测技术，而且仅仅是通过CT值来进行判读结果，不能同时对多个菌同时进行检测。CN201610765955.5专利则公开了通过分别设计三对引物、三条探针，采用荧光定量PCR法对白色念珠菌、隐球菌、曲霉菌进行检测，由于近年来非白色念珠菌病感染率明显高于白色念珠菌感染，该专利的检测范围明显较窄；CN200910038182.0专利公开了一种针对氟康唑敏感度不同的念珠菌检测试剂盒，具体检测四种或四种以上的念珠菌；CN201410820825.8专利公开了通过比对白色假丝酵母、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克柔假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、黄曲霉、烟曲霉、土曲霉、新生隐球菌、米根霉、卷枝毛霉的保守序列，设计三条引物、两条探针，荧光定量PCR检测念珠菌、隐球菌和曲霉，此方法虽然可以检测八种念珠菌，但只可检测到属，并不能具体检测到哪一种的感染；CN201710691369.5专利公开了通过设计两对引物、两条探针，多重荧光定量PCR检测隐球菌和曲霉菌属。而以上几篇专利均不能对念珠菌进行鉴定。另外，CN200910152072.7和CN201410503015.X专利公开了一种基因芯片检测念珠菌和隐球菌的试剂盒，通过杂交法对致病真菌进行检测，但该方法不仅耗时长，而且操作繁琐，同时由于开盖操作，造成污染的几率很大，远远不如本专利技术检测时间短、自动化程度高、避免PCR污染等优点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种实时荧光PCR真菌检测引物、探针、试剂盒及检测方法，可对常见致病真菌进行属的检测，且在此基础上，配合采用熔解曲线分析方法，可对念珠菌进行种鉴定。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种实时荧光PCR真菌检测引物，所述引物包括：上游引物ITSF1和下游引物ITSR1，其核苷酸序列如SEQIDNo.1-2所示。一种实时荧光PCR真菌检测探针，所述探针包括探针CaP1、探针CgP1、探针CtP1、探针CkP1、探针CpP1、探针CguP1、探针QMJP1和探针CnP1，其核苷酸序列如SEQIDNo.5-12所示。一种实时荧光PCR真菌检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括上述的实时荧光PCR真菌检测引物以及上述的实时荧光PCR真菌检测探针。一种实时荧光PCR真菌检测方法，采用上述的实时荧光PCR真菌检测试剂盒进行检测。本专利技术的有益效果在于：(1)通过实时荧光PCR方法对念珠菌属、曲霉菌属及隐球菌属进行检测。(2)同时配合采用熔解曲线分析方法，可以对念珠菌属中的白色念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌进行种鉴定。(3)采用本专利技术提供的试剂盒可以快速、准确地确定患者感染真菌情况，为病情的判断提供参考依据，为合理用药，制定个体化医疗提供参考依据。附图说明图1为本专利技术实施例的实时荧光PCR真菌检测试剂盒中的念珠菌(Cgu、Ct、Cg、Cp、Ck)基因组DNA检测熔解曲线示意图；图2为本专利技术实施例的实时荧光PCR真菌检测试剂盒中的念珠菌(Ca)基因组DNA检测熔解曲线示意图；图3为本专利技术实施例的实时荧光PCR真菌检测试剂盒中的隐球菌(Cn)基因组DNA检测熔解曲线示意图；图4为本专利技术实施例的实时荧光PCR真菌检测试剂盒中的黑曲霉、黄曲霉、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种实时荧光PCR真菌检测引物，其特征在于，所述引物包括：上游引物ITSF1和下游引物ITSR1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1‑2所示。
【技术特征摘要】
1.一种实时荧光PCR真菌检测引物，其特征在于，所述引物包括：上游引物ITSF1和下游引物ITSR1，其核苷酸序列如SEQIDNo.1-2所示。2.根据权利要求1所述的实时荧光PCR真菌检测引物，其特征在于，所述引物还包括：内控上游引物ICF1和内控下游引物ICR1，其核苷酸序列如SEQIDNo.3-4所示。3.一种实时荧光PCR真菌检测探针，其特征在于，所述探针包括探针CaP1、探针CgP1、探针CtP1、探针CkP1、探针CpP1、探针CguP1、探针QMJP1和探针CnP1，其核苷酸序列如SEQIDNo.5-12所示。4.根据权利要求3所述的实时荧光PCR真菌检测探针，其特征在于，所述探针还包括：内控探针ICP1，其核苷酸序列如SEQIDNo.13所示。5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR真菌检测探针，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo.13所示的探针，其5’端修饰HEX，3’端修饰BHQ1；核苷酸序列如SEQIDNo.5、SEQIDNo.10及SEQIDNo.11所示的探针，其5’端修饰cy5，3’端修饰BHQ3；核苷酸序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.7及SEQIDNo.9所示的探针，其5’端修饰FAM，3’端修饰BHQ1；核苷酸序列如SEQIDNo.8、SEQIDNo.12所示的探针，其5’端修饰ROX，3’端修饰BHQ2。6.一种实时荧光PCR真菌检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括权利要求1-2任意一项所述的实时荧...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹华立，赵西浩，郑银娜，裘惠良，
申请(专利权)人：杭州千基生物科技有限公司，杭州博芯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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