一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物及方法技术

一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物及方法，所述分子标记引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物trnK‑UUU‑rps16F的序列为：AGATTGAATTGCACAGCG，所述反向引物trnK‑UUU‑rps16R的序列为：TGAAGTAATCGGGTCTAT。鉴别方法包括如下步骤：(1)叶片样本的采集；(2)叶片样本总基因组DNA的提取；(3)利用鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，对步骤(2)中的叶片样本总基因组DNA中的目标基因进行扩增，得到扩增产物；(4)对步骤(3)中的扩增产物进行纯化和测序；(5)对步骤(4)中测序结果进行比对分析。基于trnK‑UUU‑rps16基因间隔区的碱基差异，正向引物和反向引物可以作为鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的种质区分的分子标记引物，且鉴别方法简单，易操作。

A molecular marker primer and method for identification of Prunus armeniaca, Siberia apricot and fresh apricot

A molecular marker primer and method for identifying Apricot, Siberian apricot and fresh apricot are described. The molecular marker primers include forward primers and reverse primers. The sequence of the forward primer trnK_UUU_rps16F is AGATTGAATTGCAGCG, and the sequence of the reverse primer trnK_UU_rps16R is TGAAGTAATCGGGTCTAT. The identification method includes the following steps: (1) collection of leaf samples; (2) extraction of total genomic DNA from leaf samples; (3) amplification of the target gene in the total genomic DNA of leaf samples in step (2) amplification of step (3) using molecular marker primers to identify Almond, Siberian apricot and fresh apricot; (4) amplification of step (3) The amplified products were purified and sequenced. (5) the sequencing results in step 4 were compared and analyzed. Based on the base difference of trnK_UU_rps16 gene spacer, forward and reverse primers can be used as molecular marker primers to distinguish the germplasm of apricot, Siberian apricot and fresh apricot, and the identification method is simple and easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物及方法
本专利技术涉及生物
具体地说是一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物及方法。
技术介绍
大扁杏(Kernel-usingapricot)为蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)杏属(Armeniaca)植物，是我国特有的生态经济型树种，也是我国六大木本粮油树种之一。主要分布于我国河北、辽宁、甘肃、内蒙古、山西和陕西省等中西部生态脆弱区。大扁杏浑身是宝，常被誉为“铁杆庄家”。与其他杏相比，大扁杏核仁香甜无苦味，富含蛋白质、脂肪、糖、维生素B17及微量苦杏仁苷等成分，可加工成干果，生产杏仁蛋白、杏仁油、化妆品、功能食品等，是优质食品、化妆品和中药材原料；大扁木材坚硬，是生产高档家具的上佳材料；大扁杏根系发达，抗寒、抗旱及耐瘠薄能力极强，是我国中西部高寒及生态脆弱区发展的优良树种，具有极高的经济、社会和生态价值，应用前景十分广阔。但我国杏属植物种质资源极为丰富，生长环境又相似，使其具有相似的形态特征等原因，生产及市场上常有以西伯利亚杏、鲜食杏冒充大扁杏的现象。伪品西伯利亚杏、鲜食杏较大扁杏的产量、出仁率、核仁含油率及口感均差，不能代替大扁杏的经济效益，因此，在市场流通时需要准确相互辨别。目前，对大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的鉴定主要通过传统的形态特征鉴别法来完成，而传统鉴定方法需要3-5年的生长周期，不利于推广。近年来，随着分子生物学及生物信息学的飞速发展，DNA条形码鉴别技术因不受环境及形态特征的影响，操作简单易行，且重复性和稳定性高等优点，已成为动植物鉴定有效工具。植物DNA条形码中，可用的基因组DNA有核基因组DNA(nrDNA)、叶绿体基因组DNA(cpDNA)和线粒体基因组DNA(mtDNA)，其中，nrDNA的进化速率最快，是细胞核内全自主的遗传系统，其结构与组成极为复杂，各基因家族形成功能调控网络，并且很多基因出现多拷贝现象，存在直系同源和旁系同源等问题。而mtDNA易发生基因重排、重复和丢失，并且植物mtDNA拷贝数较低，提取和纯化较难，因此，在植物鉴定中mtDNA的应用范围有限。相比于nrDNA和mtDNA，cpDNA既不存在较多的重复序列，也不出现频繁的重排事件，它不受遗传重组的影响，对鉴别复杂的物种具有特殊意义。同时，叶绿体基因组绝大数属于母系遗传，具有相对独立的演化路线，其进化速率适中，较适用于属及种等低分类阶元的鉴定分析。植物叶绿体trnK-UUU-rps16基因间隔片段进化速度较慢，在属及种的水平上遗传变异较小，具有通用性强、易扩增等特点，在植物鉴别研究中常选取作为分子鉴定的DNA条形码。可以结合DNA快速提取检测技术，寻找和建立杏属植物便捷的鉴定方法。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子鉴别引物及方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，分子标记引物为叶绿体基因组。上述的鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，所述分子标记引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物trnK-UUU-rps16F的序列为(如SEQIDNO:1所示)：AGATTGAATTGCACAGCG，所述反向引物trnK-UUU-rps16R的序列为(如SEQIDNO:2所示)：TGAAGTAATCGGGTCTAT。一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的方法，包括如下步骤：(1)叶片样本的采集；在步骤(1)中，采集各地区鲜嫩、健康和无病虫害的大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的叶片样本，组成大扁杏叶片样本群、西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群。(2)叶片样本总基因组DNA的提取；在步骤(2)中，通过植物DNA快速提取试剂盒，提取大扁杏叶片样本、西伯利亚杏叶片样本和鲜食杏叶片样本的总基因组DNA。(3)利用鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，对步骤(2)中的叶片样本总基因组DNA中的目标基因进行扩增，得到扩增产物；在步骤(3)中，鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，包括正向引物和反向引物；所述正向引物trnK-UUU-rps16F的序列为(如SEQIDNO:1所示)：AGATTGAATTGCACAGCG，所述反向引物trnK-UUU-rps16R的序列为(如SEQIDNO:2所示)：TGAAGTAATCGGGTCTAT；所述目标片段序列为：trnK-UUU-rps16。在步骤(3)中，PCR扩增反应体系为：为25uL的混合体系，包括9.5μL的无菌去离子水ddH2O，1μL的叶片样本总基因组DNA，12.5μL的2×TabMasterMix，1μL的正向引物和1μL的反向引物；所述叶片样本总基因组DNA的浓度为10-20ng·μL-1；PCR反应程序为：(P-1)95℃预变性5min，(P-2)95℃变性30s，(P-3)52℃的退火30s，(P-4)72℃延伸30s，(P-5)步骤(P-1)到步骤(P-4)循环30次，(P-6)72℃终延伸5min。(4)对步骤(3)中的扩增产物进行纯化和测序；在步骤(4)中，用DNA分析仪对步骤(3)中得到PCR扩增产物，进行检测。(5)对步骤(4)中测序结果进行比对分析。在步骤(5)中，用GENEDOC和DNAMAN软件进行序列比对，获得大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的碱基差异，进行物种间的鉴别。在步骤(5)中，将大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的碱基差异作为鉴别种质的分子标记，大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的碱基差异如下：(1)在第92个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为T，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为G；(2)在第131碱基位置处大扁杏叶片样本群有碱基AAATATTT的插入，而西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在此处有碱基AAATATTT的缺失；(3)在第151个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为T，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为C；(4)在第178碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群有碱基ATTAGA的插入，而西伯利亚杏叶片样本群在此处有碱基ATTAGA的缺失；(5)在第230个碱基位置处大扁杏叶片样本群的碱基为A，而西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在此处的碱基为C；(6)在第385碱基位置处西伯利亚杏叶片样本群有碱基A的插入，而大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在此处有碱基A的缺失；(7)在第425个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为TT，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为AA；(8)在第551个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为T，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为G；(9)在第560碱基位置处西伯利亚杏叶片样本群有碱基AA的插入，鲜食杏叶片样本群在此处有碱基A的插入，而大扁杏叶片样本群在此处有碱基A的缺失。有益效果1.利用正向引物trnK-UUU-rps16F和反向引物trnK-UUU-rps16R对大扁杏叶片、西伯利亚杏叶片和鲜食杏叶片样本的总基因组DNA扩增，对扩增得到的叶绿体DNAtrnK-UUU-rps16基因间隔短片段序列比对结果，可看出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，其特征在于，分子标记引物为叶绿体基因组。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，其特征在于，分子标记引物为叶绿体基因组。2.根据权利要求1所述的鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物trnK-UUU-rps16F的序列为AGATTGAATTGCACAGCG，所述反向引物trnK-UUU-rps16R的序列为TGAAGTAATCGGGTCTAT。3.一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)叶片样本的采集；(2)叶片样本总基因组DNA的提取；(3)利用鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，对步骤(2)中的叶片样本总基因组DNA中的目标基因进行扩增，得到扩增产物；(4)对步骤(3)中的扩增产物进行纯化和测序；(5)对步骤(4)中测序结果进行比对分析。4.根据权利要求3所述的鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采集各地区鲜嫩、健康和无病虫害的大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的叶片样本，组成大扁杏叶片样本群、西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群。5.根据权利要求4所述的鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的方法，其特征在于，在步骤(2)中，通过植物DNA快速提取试剂盒，提取大扁杏叶片样本、西伯利亚杏叶片样本和鲜食杏叶片样本的总基因组DNA。6.根据权利要求3所述的鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的方法，其特征在于，在步骤(3)中，鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，包括正向引物和反向引物；所述正向引物trnK-UUU-rps16F的序列为AGATTGAATTGCACAGCG，所述反向引物trnK-UUU-rps16R的序列为TGAAGTAATCGGGTCTAT；所述目标片段序列为：trnK-UUU-rps16。7.根据权利要求6所述的鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR扩增反应体系为：为25uL的混合体系，包括9.5μL的无菌去离子水ddH2O，1μL的叶片样本总基因组DNA，12.5μL的2×TabMasterMix，1μL的正向引物和1μL的反向引物；所述叶片样本总基因组DNA的浓度为10-20ng·μL-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：包文泉，敖敦，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15