辣椒熟性SNP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了辣椒熟性SNP分子标记及其应用，所述辣椒熟性SNP分子标记含有如SEQ ID NO.1所示的序列。本发明专利技术利用BSR‑Seq(Bulked Segregant RNA‑Seq)技术，快速鉴定控制始花节位的染色体位点，针对该位点特定SNP开发辣椒熟性分子标记。利用本发明专利技术提供的分子标记及其扩增引物，结合特定的限制性内切酶处理，可在子叶期快速、准确筛选出特早熟辣椒，实现辣椒熟性育种的分子标记辅助选择，提高育种选择效率，在辣椒熟性育种中具有重要应用价值。

Capsicum maturity SNP molecular marker and its application

The invention discloses a pepper maturity SNP molecular marker and its application. The pepper maturity SNP molecular marker contains a sequence as shown in SEQ ID NO.1. The invention utilizes the BSR Seq (Bulked Segregant RNA Seq) technique to rapidly identify the chromosome loci controlling the initiation flower node, and develops the molecular markers of pepper maturity for the specific SNP of the locus. Using the molecular markers and amplified primers provided by the invention, combined with specific restriction endonuclease treatment, the extra-early-maturing pepper can be quickly and accurately screened out at the cotyledon stage, and the molecular marker-assisted selection of pepper maturity breeding can be realized, and the breeding selection efficiency can be improved. The method has important application value in Pepper maturity breeding.

【技术实现步骤摘要】
辣椒熟性SNP分子标记及其应用
本专利技术涉及分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及辣椒熟性SNP分子标记及其应用。
技术介绍
辣椒(Capsicumspp.)是茄科重要经济作物，在世界各地广泛种植，辣椒是我国主要蔬菜作物之一。辣椒植株为合轴分枝结构，主茎生长到一定时候停止生长，其顶端分生组织转化为花序分生组织，花序分生组织在适宜的内在条件和外在环境(如日照长度和温度)下发育为单生花，开花标志着主茎生长的终止，由侧生分生组织生长发育为新枝，不久新枝又停止生长，继续由新枝顶端的侧生分生组织代替顶端分生组织生长，不断重复形成合轴分枝。辣椒第一朵花的着生节位称为始花节位，一般以主茎上从子叶到第一朵花之间的真叶(节位)数来度量。始花节位是辣椒的重要熟性性状，是辣椒品种改良的主要目标之一。始花节位低的辣椒品种往往开花坐果早，在春茬种植中能提早上市，适度规避雨水和病虫害，降低农药使用量，提高种植经济效益；在秋茬种植中可规避后期低温环境，减少设施栽培能耗。始花节位高的辣椒品种开花坐果晚，能避开上市旺季，满足市场多样化需求。基于始花节位开发辣椒熟性分子标记能进行超早期选择，加快育种进程，对辣椒熟性育种具有重要指导作用。自然变异中辣椒始花节位受少数主效基因和部分微效基因控制，同时也受温度和光照等环境影响，为数量性状，传统的表型选择精准性不高。目前已有的辣椒始花节位分子标记多与目标基因遗传距离较远，或在使用上局限性较大。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种辣椒熟性分子标记及其应用。本专利技术提供一种辣椒熟性分子标记，其含有位于辣椒CM334基因组(v1.55)第4号染色体142,998,685处的多态性为T/C的核苷酸序列或含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的第457位多态性为T/C。本专利技术利用BSR-seq技术发现辣椒早熟植株中一个AP2家族转录调控因子的起始密码子发生突变，该特定的SNP位点的碱基由T突变为碱基C。所述特定SNP位点位于已测序辣椒CM334基因组(v1.55)第4号染色体142,998,685处，即如SEQIDNO.1所示序列的第457位，该位点碱基为CC的纯合基因型对应辣椒早熟性状，为碱基TT的纯合基因型或CT杂合基因型对应辣椒晚熟性状。根据该SNP位点开发所述辣椒熟性分子标记。所述辣椒熟性分子标记可以由如下引物扩增得到：SEQIDNO.2：TAAAAGTGGCCTAGTCCATGTCTGSEQIDNO.3：GCCATATCTATAGGCTTAGCCAATC进一步地，本专利技术提供所述辣椒熟性分子标记的扩增引物。优选地，其具有如下核苷酸序列：SEQIDNO.2：TAAAAGTGGCCTAGTCCATGTCTGSEQIDNO.3：GCCATATCTATAGGCTTAGCCAATC利用本专利技术提供的分子标记，可以实现辣椒熟性的快速准确鉴定。因此，本专利技术还提供了所述的辣椒熟性分子标记或其引物在鉴定辣椒熟性性状中的应用。具体地，所述应用包括如下步骤：(1)提取待测辣椒种质的基因组DNA；(2)以待测辣椒种质基因组DNA为模板，利用所述辣椒熟性分子标记的扩增引物，进行PCR扩增反应；(3)分析扩增产物的SNP位点，该位点碱基为CC的纯合基因型对应辣椒早熟性状，为TT的纯合基因型或CT的杂合基因型对应辣椒晚熟性状。本领域技术人员应该理解，分析SNP位点碱基类型的方法有很多，包括测序分析、等位基因特异性PCR分析、酶切产物多态性分析等。优选地，步骤(3)中分析所述扩增产物的SNP位点为采用限制性内切酶酶切PCR扩增产物后，对酶切产物进行特征条带电泳检测，判断所述SNP位点碱基类型。更优选地，所述限制性内切酶为特异性识别ACGT的限制性内切酶TaiI。在本专利技术提供的具体实施方式中，所述PCR扩增反应的体系和程序以及TaiI限制性内切酶的酶切反应体系和程序如下：PCR扩增反应体系为：2×EsTaqMasterMix(Dye)5μL，10μM正向引物FFN1-5UF4和10μM反向引物FFN1-e1R2各0.2μL，100ng/μLDNA模板0.6μL，ddH2O补齐至10μL。其中，EsTaqMasterMix来自康为世纪生物科技有限公司的商品化试剂盒CW0690。PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，38个循环；72℃延伸10min。限制性内切酶TaiI酶切反应体系为：10×BufferR0.65μL，PCR产物3.5μL，TaiI限制性内切酶0.1μL，ddH2O补齐至10μL，65℃酶切反应15h。其中，TaiI限制性内切酶来自ThermoScientific的商品化限制性内切酶ER1141。本领域技术人员应该知晓，PCR的扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序可以根据所用DNA聚合酶、限制性内切酶不同或其它需要调整其中各组分的体积和/或用量以及各反应的温度和时间，因此，本专利技术所述的PCR扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序的选择包括但不限于上述扩增体系和反应程序。始花节位是辣椒的重要熟性性状，始花节位的高低决定了辣椒的早熟或晚熟，始花节位低的辣椒品种一般开花坐果早，表现为早熟性状；始花节位高的辣椒品种开花坐果晚，表现为晚熟性状。因此本专利技术还提供了所述的分子标记和/或其引物在鉴定辣椒始花节位以及在辣椒分子标记辅助育种中的应用。最后，本专利技术提供了含有所述分子标记的引物的检测试剂或含有所述检测试剂的试剂盒。所述试剂盒还包含dNTPs、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、限制性内切酶和标准阳性模板中的一种或多种。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术提供的分子标记能够准确、特异地鉴定辣椒熟性性状，实现辣椒早熟和晚熟种质的子叶期早期鉴定。(2)利用本专利技术提供的分子标记的引物进行扩增，结合限制性内切酶酶切分析扩增产物，根据酶切产物条带特征即可判断辣椒熟性，无需测序或繁杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳操作，检测的准确率最高可达100％，且具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。(3)应用本专利技术提供的分子标记对辣椒种间杂交后代分离世代连续进行多代分子标记辅助选择，与辣椒其他优良性状聚合过程中，可于子叶期快速准确区分始花节位≤4节的超早熟辣椒单株与＞4节的相对晚熟辣椒单株，方便进行精准的超早熟辣椒分子标记辅助选择育种，大大加快育种进程。附图说明图1为本专利技术实施例1中两个极端池SNPs位点delta值全基因组扫描结果。图2为本专利技术分子标记CSF2对应的SNP位点示意图。图3为本专利技术实施例2中利用辣椒熟性SNP分子标记鉴定辣椒杂交后代的始花节位的部分电泳结果图；其中，M：DNAMarker；A：晚熟辣椒A145；B：特早熟辣椒B9431；F1：B9431和A145杂交获得的F1代植株；F2：B9431和A145杂交所得F1自交获得的F2群体中随机挑选的单株；E：始花节位为1-4节的超早熟辣椒；L：始花节位大于4节的相对晚熟辣椒。图4为本专利技术实施例3中利用辣椒熟性SNP分子标记鉴定92份辣椒种质材料的始花节位的电泳图；其中，M：DNAMarker；B：特早熟辣椒B9431；A：晚熟辣椒A145；F1：B9431和A145杂交获得的F1代植本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.辣椒熟性分子标记，其特征在于，其含有位于辣椒CM334基因组第4号染色体142,998,685处的多态性为T/C的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.辣椒熟性分子标记，其特征在于，其含有位于辣椒CM334基因组第4号染色体142,998,685处的多态性为T/C的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的辣椒熟性分子标记，其特征在于，其含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列的第457位多态性为T/C。3.权利要求1或2所述的辣椒熟性分子标记的引物。4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，具有如下核苷酸序列：SEQIDNO.2：TAAAAGTGGCCTAGTCCATGTCTGSEQIDNO.3：GCCATATCTATAGGCTTAGCCAATC。5.权利要求1或2所述的辣椒熟性分子标记或权利要求3或4所述的引物在鉴定辣椒熟性性状中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测辣椒种质的基因组DNA；(2)以待测辣椒种质...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁欣捷，陈学军，方荣，周坤华，
申请(专利权)人：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36