墨旱莲的检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种墨旱莲特异性SCAR分子标记，还公开了扩增该分子标记序列的引物对及其用途，还公开了墨旱莲的检测试剂盒和检测方法。本发明专利技术检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的鉴别墨旱莲，特异性强，耗时短，应用前景良好。

Detection kit and detection method of Herba prostrata

The invention discloses a specific SCAR molecular marker of Eclipta, a pair of primers for amplifying the molecular marker sequence and its application, and a test kit and a test method for Eclipta. The detection kit and the detection method of the invention can accurately and effectively distinguish Eclipta japonica with strong specificity, short time-consuming and good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
墨旱莲的检测试剂盒和检测方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种墨旱莲的检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
墨旱莲为菊科植物鳢肠(Ecliptaprostrate)的全草，每年夏、秋两季割取全草，除去泥沙，晒干或阴干即可入药。由于搓揉它的茎叶时，可见黑色的汁液流出而得名。全草药用，主要含有三萜类，香豆草醚类，黄酮类，甾体类，噻吩类和挥发油等物质，具有很强的免疫调节、保肝、抗纤维化、抗肿瘤、抗自由基抗氧化和酶激活等药理作用，临床上常用于治疗吐血、衄血、尿血、便血、血痢、刀伤出血、须发早白、白喉、淋浊、带下、阴部湿痒等症。但墨旱莲和赶黄草形态相似，容易混淆，从而影响用药的准确性。因此，有效鉴别墨旱莲，是非常必要的。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种方便、快速、准确地检测墨旱莲的试剂盒和方法。本专利技术提供了一种墨旱莲特异性SCAR分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了扩增SEQIDNO.1所示核苷酸序列的引物对。其中，它是SEQIDNO.2～3所示的引物对。本专利技术还提供了上述SCAR分子标记、上述引物对在检测墨旱莲中的用途。本专利技术还提供了一种墨旱莲的检测试剂盒，包括检测SEQIDNO.1所述核苷酸序列的试剂。其中，所述试剂包括扩增SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂。其中，所述扩增的试剂包括SEQIDNO.2～3所示的引物对。其中，所述墨旱莲为产自四川、江西、安徽的墨旱莲。本专利技术还提供了一种墨旱莲的检测方法，包括如下步骤：a、DNA提取：提取待检样本中的DNA；b、检测：用上述试剂盒检测待检样本，即可。本专利技术通过检测墨旱莲特异性SCAR分子标记，可以有效鉴定待检样本是否为墨旱莲，将墨旱莲与赶黄草及其它植物种类进行准确区分，为墨旱莲药材的合理使用提供指导，本专利技术方法操作简便，具有良好的应用前景。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1.墨旱莲的改良RAPD扩增。箭头为N7-11的RPAD片段，用于胶回收和克隆。通道1-9是分别是来自江西、安徽、陕西、湖南、四川泸州、四川西昌、贵州、湖北和山西的赶黄草，10为来自泸州的墨旱莲。图2阳性克隆的菌落PCR鉴定。黑色所指通道的阳性克隆用于Sanger测序。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。泳道1-2分别代表不同阳性克隆的菌落。图3不同墨旱莲品种的鉴定。通道1、2和3是来自四川、江西和安徽的墨旱莲；4，5，6是来自四川，江西和安徽的赶黄草。图4不同物种及墨旱莲品种的鉴定。通道1-14号分别为赶黄草，墨旱莲，青果，桂圆，荔枝，薄荷，枸杞，当归，银杏，苦蒿，红芝，紫芝，栀子，艾草。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本专利技术不局限于这些实施例。本专利技术具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。实施例1RAPD技术扩增墨旱莲特异SCAR标记一、CTAB法提取植物DNA取墨旱莲0.2g置于1.5mLEP管中，加入液氮半分钟后用研钵棒碾碎成细粉，立即加入500μl的CTAB提取缓冲液[CTAB2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol.L-1，EDTA20mmolmmol.L_1，NaCL1.4mol.L_1，0.4％的β-巯基乙醇]，60℃水浴保温1小时后，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)抽提，轻颠倒混匀，10000转每分钟离心10分钟，吸取上清液，取上清加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；12000转每分钟离心10分钟，弃上清，小心倾去上清液，沉淀用70％乙醇和无水乙醇各轻洗一次，弃洗液，留沉淀，空气干燥。用100μl的1×TE溶液溶解备用。将样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用分光光度计测定浓度，稀释至浓度10ng/μl，-20℃保存备用。详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)。二、RAPD技术PCR扩增利用RAPD技术进行扩增(参照FuJ,YangL,KhanMA,MeiZ(2013)GeneticcharacterizationandauthenticationofLonicerajaponicaThunb.byusingimprovedRAPDanalysis.MolBiolRep,40(10):5993-9)：以步骤一提取的核酸作为模板，用RAPD引物SBS-N7进行扩增(序列见表2，北京赛百盛公司合成)，PCR扩增采用10μl反应体系包括：1μl的引物(2.5μmol/L),1.5μl(15ng)模板DNA，5μl的2×PCRTaqMastermix(天根生物公司，北京)和2.5μl的灭菌双蒸水。充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(AppliedBiosystems96-WellThermalCycler，LifeTechnology,USA)。PCR反应条件是：95℃1分30秒,94℃40秒，36度60秒，72℃1分30秒，40个循环，最后72℃5分钟，其中RAMP为5％。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。表1琼脂糖凝胶电泳(参见《精编医学分子生物学实验指导》，中国医药科技出版社，主编：傅俊江)：(1)制备1.5％的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样一个DNA分子大小标记(DL2000，TIANGEN公司，北京)。注意：不需要加载样缓冲液，PCR扩增用的2×mix就预加了相关成分。(2)电泳(电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMIDIcell)，常选择电压110V，电泳时间30min即可，三、RAPD扩增条带的分离1.片段回收1.5％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下剪切图1正品墨旱莲品种的特异片段，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物公司)回收RAPD扩增的DNA片段。2.克隆接着利用pGEM-T载体(PromegaCorporation)和回收RAPD扩增的DNA片段在T4-DNA连接酶作用下连接(16℃连接8小时)。连接后加入30μl活化的DH5α细菌，冰浴30分钟，接着42℃激活45秒，然后冰浴2分钟，再加入300μl无氨苄青霉素的LB培养基(配制方法：12.5克LB粉加500ml水高温灭菌)200转每分钟摇动45分钟，然后将液体均匀涂抹在含氨苄青霉素的固体LB培养基表面，37℃培养15小时[固体培养基配制方法：12.5克LB粉，7.5克琼脂粉和500毫升水高温灭菌后，在50℃时加入500μl的氨苄青霉素(100mg/ml)，使用前在固体培养基表面涂抹40μl的20mg/ml的X-GAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和20μl的24mg/ml的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)]进行蓝白筛选，筛选白色菌落进行菌落PCR鉴定。3.阳性克隆鉴定每个皿挑选多个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种墨旱莲特异性SCAR分子标记，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种墨旱莲特异性SCAR分子标记，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.扩增SEQIDNO.1所示核苷酸序列的引物对。3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：它是SEQIDNO.2～3所示的引物对。4.权利要求1所述的SCAR分子标记、权利要求2-3所述的引物对在检测墨旱莲中的用途。5.一种墨旱莲的检测试剂盒，其特征在于：包括检测SEQIDNO.1所述核苷酸序列的试剂。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅志强，傅俊江，刘晓燕，郑美玲，
申请(专利权)人：西南医科大学，
类型：发明
国别省市：四川,51