本发明专利技术提供一组用于鉴定宁麦9号及其衍生品种赤霉病抗性的引物对及应用，所述引物对序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，利用该引物对小麦基因组DNA进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后，若扩增产物中含有819 b大小的条带，则说明待测小麦有赤霉病抗性基因，反之，则为易感小麦；该方法快速而直观获得小麦品种赤霉病抗性结果，适用于大规模育种筛查。
Primer pairs for identifying scab resistance of Ningmai 9 and its derived varieties and their application
The present invention provides a set of primer pairs for identifying the resistance of Ningmai 9 and its derivatives to scab and their application. The primer pair sequences are shown as nucleotide sequences SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2, respectively. After PCR amplification and agarose gel electrophoresis of wheat genomic DNA using the primer, if the amplified products contain 819B large enough The small bands indicated that the tested wheat had resistance genes to scab, whereas the wheat was susceptible to scab. This method could quickly and intuitively obtain the resistance results of wheat varieties to scab, which was suitable for large-scale breeding screening.
【技术实现步骤摘要】
用于鉴定宁麦9号及其衍生品种赤霉病抗性的引物对及应用
本申请涉及小麦育种领域，特别是一组用于鉴定宁麦9号及其衍生品种赤霉病抗性的引物对及其应用。
技术介绍
小麦赤霉病是由镰刀菌引起的一种世界范围内广泛流传的重大真菌病害，也是危害我国小麦生产的重要病害之一。近年来，由于气候变暖和耕作制度的改变，我国小麦赤霉病发病范围呈不断扩大趋势，目前常发区已从传统发病区域为长江中下游冬麦区和东北春麦区扩展到黄淮南部麦区，黄淮北部、西南、西北麦区病害发生也明显加重。近五年全国年均发病面积超过小麦种植面积的20%。赤霉病会导致小麦产量下降，一般发生年份引起10%-15%的减产，大流行时甚至绝收。赤霉病不仅造成小麦产量严重降低，其分泌的脱氧雪腐镰刀烯醇（deoxynivalenol，DON）等真菌毒素会影响小麦的品质及食品安全，严重危害人畜健康。因此，积极有效地防控小麦赤霉病对粮食安全和食品安全都具有十分重要意义。宁麦9号是江苏省主推的优质高产抗病弱筋小麦主栽品种，是以当地品种扬麦6号为母本，日本品种西风为父本，采用改良集团法选育而成。该品种具有优质弱筋专用品质及抗小麦黄花叶病、赤霉病等特点，以该品种为亲本已经育成了一批适于长江中下游麦区种植的小麦新品种，是我国小麦育种的重要亲本。其中2006年以来通过国家或江苏省审定的品种已达至少14个。宁麦9号作为新一代骨干亲本，对选育高产、优质、抗病小麦新品种具有重要的价值。通过选择特异性引物并将其应用于以宁麦9号及衍生品种为母本的抗赤霉病分子标记辅助育种中，可以有效提高小麦杂交育种早世代赤霉病抗性选择的有效性。目前，针对宁麦9号及衍生品种赤霉病抗性检测的引物尚未见报道。
技术实现思路
针对上述问题，为了快速鉴定9号及其衍生品种中赤霉病抗性，并能使该抗性QTL在以宁麦9号为亲本的小麦育种中得到可靠应用，申请人根据抗感品种之间存在的序列差异，设计了一个一般的实验室可操作、利用琼脂糖凝胶电泳即可分辨的引物，并将其应用于小麦的抗赤霉病分子标记辅助育种中。通过选择特异性分子标记并将其应用于以宁麦9号及衍生品种为母本的抗赤霉病分子标记辅助育种中，可以有效提高小麦杂交育种早世代赤霉病抗性选择的效率。本专利技术的目的是这样实现的：一对用于鉴定宁麦9号及其衍生品种的抗赤霉病基因的引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。核苷酸序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对在鉴定鉴定9号及其衍生品种赤霉病抗性中的应用，即以待测小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，再对扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳分离检测，若扩增产物中含有819bp左右大小的条带，则待测小麦有宁麦9号赤霉病抗性，否则待测小麦无赤霉病抗性。在上述的引物序列的应用中：PCR扩增的反应体系（25μL）为：20-100ng的待测小麦基因组DNA，5U/μL的Taq酶0.25μL，10μmol/L的SEQIDNO.1和SEQIDNO.2各1μL，10mmol/L的dNTP0.5μL，10×PCR的Mg2+Plus缓冲液2.5μL，余量为无菌蒸馏水；PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min，随后94℃变性30sec,58℃条件下退火30sec,72℃延伸40sec，进行35个循环；最后72℃延伸5min;在4℃下保存。对扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳分离检测的是指：将扩增产物在质量分数为0.8%-2%的琼脂糖凝胶（含终浓度为0.5μg/mL的EB）中电泳分离，电压130V，电泳时间20min，判断扩增产物中是否含有819bp的条带。本申请中，宁麦9号衍生品种是指：以宁麦9号为亲本育成的品种，优选宁麦13、宁麦14、宁麦18、生选4号、生选6号、镇麦5号、镇麦8号、扬麦18和扬辐麦4号。本申请中，小麦抗性评价标准参见《小麦品种赤霉病抗性鉴定规程》。本专利技术的有益在于：针对宁麦9号及其衍生品种设计赤霉病抗性引物，通过SEQIDNO.1和SEQIDNO.2对小麦基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物通过琼脂糖电泳进行标记的检测，不需要利用测序仪或者非变性凝胶电泳来进行检测，操作简单；本申请直接以PCR产物电泳能否扩增出819bp大小条带来判定小麦材料是否含有宁麦9号赤霉病抗性基因，非常直观，不需要通过测序或者比较条带的大小。附图说明图1：利用琼脂糖电泳检测引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2对赤霉病抗感品种的扩增结果。M：分子量标准DL2000；1-8泳道依次为小麦品种宁麦9号、宁麦13号、宁麦14号、生选6号、扬辐麦4号、安农8455、Clark、阿夫。具体实施方式实施例中涉及的小麦品种、病原菌（禾谷镰刀菌FG0609）均来自江苏省农业科学院粮食作物研究所小麦研究室保藏；DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，型号DP305。实施例1筛选与宁麦9号相关的抗赤霉病QTL位点并设计特异性引物本实施例利用宁麦9号和扬麦158杂交后代重组自交系（RIL）群体对赤霉病抗性进行了QTL定位。重组自交系材料在2015-2016、2016-2017连续两个生长季种植于江苏省农科院院内试验基地，并参照《小麦品种赤霉病抗性鉴定规程》对重组自交系材料进行了赤霉病抗性鉴定。利用植物基因组DNA提取试剂盒（天根DP305）提取DNA，利用Illumina90k基因芯片对试验材料进行基因组扫描（具体信息参见：Wang等，2014，Characterizationofpolyploidwheatgenomicdiversityusingahigh‐density90000singlenucleotidepolymorphismarray），采用基于复合混合线性模型作图的IciMapping4.1软件进行QTL定位分析，最终发现宁麦9号抗赤霉病主效QTL位于BS00098868_51和Tdurum_contig80344_144分子标记之间。针对上述分子标记区间位点进一步设计上下游引物分别如SEQIDNO.1所示和SEQIDNO.2所示：上游引物SEQIDNO.1：5’-CGCCTAGGTGAAGCTAAGAT-3’；下游引物SEQIDNO.2：5’-GGGCAGAGATTCTTTCCTTT-3’。实施例2该引物在宁麦9号及衍生品种中的特异性扩增检测方法：分别以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为引物，以待测小麦（小麦品种：宁麦9号、宁麦13号、宁麦14号、生选6号、扬辐麦4号、安农8455、Clark、阿夫。）基因组DNA（DNA提取方法参见DNA提取试剂盒说明书）为模板进行进行PCR扩增。PCR反应体系为：20ng的DNA，5U/μL的Taq酶0.25μL，10μmol/L的SEQIDNO.1和SEQIDNO.2各1μL，10mmol/L的dNTP0.5μL，10×PCR的Mg2+Plus缓冲液2.5μL，然后用无菌蒸馏水补充反应体系至25μL；PCR反应程序：将反应体系在94℃预变性5min，随后94℃变性30sec,58℃条件下退火30sec,72℃延伸40sec，进行35个循环；最后72℃延伸5min;在4℃下保存。将扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中（含终浓度为0.5μg/mL的EB）电本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于鉴定宁麦9号及其衍生品种赤霉病抗性的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.用于鉴定宁麦9号及其衍生品种赤霉病抗性的引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。2.如权利要求1所述引物对在鉴定宁麦9号及其衍生品种赤霉病抗性中的应用。3.如权利要求2所所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：分别以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为引物，以待测小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物中含有819bp大小的条带，则判定待测小麦为含有宁麦9号抗赤霉病基因的小麦，否则为感病小麦。4.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：何漪，张旭，马鸿翔，吴磊，姜朋，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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