一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽。该检测方法包括步骤：(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。本发明专利技术的试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且试剂盒操作简便，极大地降低了成本。

A detection kit for equine cryptosporidiosis and its detection method

The invention provides a detection kit for equine cryptosporidiosis and a detection method thereof. The kit contains 6 amino acids expressed in SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.6. The detection method consists of the following steps: (1) isolating the sample and suspending the isolated cells in serum-free medium; (2) co-incubating the suspended cells with six peptides with amino acid sequences SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.6, and then adding highly specific mouse anti-human IgG into the co-incubated system. The antibody reacts with antigen and antibody; (3) Wash the system after reacting with antigen and antibody, then add the chromogenic substrate for chromogenic reaction, count the spots generated by the reaction. The reagent kit of the invention can be manually synthesized in full sequence, has the advantages of convenient and fast production, high stability and specificity, and is easy to operate and greatly reduces the cost.

【技术实现步骤摘要】
一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于兽医医疗检测
，具体涉及一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
隐孢子虫(Cryptosporidium)是重要的食源性和水源性人兽共患原虫之一，属内种类和基因型较多，多数具有宿主适应性，对宿主的致病性存在差异，同时其基因型分布存在地理特征。隐孢子虫病被认为是人类最常见的6种腹泻疾病之一，免疫功能正常者呈自限性感染，而对儿童、HIV感染者及免疫缺陷疾病患者则引起急性、迁延性和慢性腹泻，甚至导致死亡。近年来基于分子生物学检测，马感染的隐孢子虫种类/基因型呈现多样性，以微小隐孢子虫和隐孢子虫基因型为主要感染种类/基因型，世界范围内，马隐孢子虫感染率为0-37％，为快速准确检测出马属隐孢子虫病，可以通过抗原与抗体的特异性结合，根据循环外周血中马属隐孢子虫病的抗体的数量，可判断是否感染马属隐孢子虫病，用于马属隐孢子虫病感染的临床辅助诊断，可以快速、敏感的检测出人体的感染情况。寄生于马属动物的隐孢子虫不仅可导致幼龄动物严重腹泻甚至死亡，而且可引起人体感染，具有重要的公共卫生意义。目前还没有比较有效的专门针对马属隐孢子虫病的精确检测手段。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。为了实现上述目的，本专利技术提供一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒，其包括氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示的6条多肽，分别为：SEQIDNO.1：GluGluGlyAlaGluAlaAlaValLeuLeuAlaAlaAlaGlyIleGlnGlySerThrAla；SEQIDNO.2：GlnGluLeuGluSerGluAlaGlyGlyIleArgValThrAlaSerAlaArgThrGlyGly；SEQIDNO.3：ThrMetGlyAlaGlyIleGluArgArgGluThrAlaAlaProAlaThrAlaThrGlyAla；SEQIDNO.4：GluAlaMetAspLeuLeuSerGluAlaGluAlaThrIleAlaSerThrGlyGlyAlaAla；SEQIDNO.5：GlyLeuThrIleValGlyGluGlySerLeuLysAlaGlyAlaAlaThrAlaIleGlyGlu；SEQIDNO.6：ThrAlaIleGluGlyAspSerAlaThrGlyLeuGluAlaAlaMetSerAlaIleGlyAla。本专利技术中，氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示的6条多肽在试剂盒中作为TB刺激物，用于检测反应。优选地，在所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒中，氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示的6条多肽中的每一条的含量为10mg。优选地，所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒还包括无血清培养基。优选地，所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒还包括分离液。优选地，所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒还包括高特异性鼠抗人IgG抗体和/或马属隐孢子虫病感染阳性刺激物。优选地，所述马属隐孢子虫病的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法的显色试剂，如NBT/BCIP显色系统，最终显色蓝紫色斑点，或AEC显色系统，最终显色红色斑点。本专利技术还提供利用前述马属隐孢子虫病的检测试剂盒对马属隐孢子虫病进行检测的方法，包括如下步骤：(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列如进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。步骤(1)中，所述将分离好的细胞重悬于无血清培养基中优选保持细胞浓度为1.0×105～3.0×105细胞/mL。步骤(2)中，所述重悬后的细胞优选加入96孔板中，所述加入氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示的6条多肽优选加入96孔板中与重悬后的细胞混合以进行共孵育。所述重悬后的细胞的添加量更优选每个反应孔为100μL，所述氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示的6条多肽的添加量优选每个反应孔中的终浓度为5μL。所述共孵育的时间优选16～20小时。如本领域常规，步骤(2)在操作时，优选设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为马属隐孢子虫病阳性刺激物；所述阴性对照为无血清培养基留白，即反应孔中只添加无血清培养基，不添加任何其他试剂。必须要指出的是，本专利技术所述的对马属隐孢子虫病进行检测的方法属于针对体外分离样本进行鉴定定性的检测方法，仅以获得待测样本中是否被马属隐孢子虫病刺激而感染的数量为直接结果和目的，并不涉及对人体健康状况的判断，不属于与疾病诊断相关的方法。本专利技术中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术除特别说明之外，所用的百分比都是体积百分比。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的包括氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示的6条多肽的检测试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且相比传统方法检测的过程大大简化，极大地降低了成本。利用该试剂盒对分离的体外样本进行检测方便快捷，可控性和精确性均非常理想，且试剂盒操作简便。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术基于马属隐孢子虫病的免疫应答机制，设计出能够人工全序列合成的6条多肽作为检测物(即序列表中的多肽1～多肽6，氨基酸编码序列对应为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6)，经过大量的实验验证，并经和现有的检测方法对比，具有明显优势，本专利技术的包括氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示的6条多肽的试剂盒及利用其对体外马属隐孢子虫病感染待测样本进行检测的方法具有方便快捷、准确度高、成本低等优势，具有良好的应用前景。氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6的6条多肽，具体分别为：SEQIDNO.1：GluGluGlyAlaGluAlaAlaValLeuLeuAlaAlaAlaGlyIleGlnGlySerThrAla；SEQIDNO.2：GlnGluLeuGluSerGluAlaGlyGlyIleArgValThrAlaSerAlaArgThrGlyGly；SEQIDNO.3：ThrMetGlyAlaGlyIleGluArgArgGluThrAlaAlaProAlaThrAlaThrGlyAla；SEQIDNO.4：GluAlaMetAspLeuLeuSerGluAlaGluAlaThrIleAlaSerThrGlyGlyAlaAla；SEQIDNO.5：GlyLeuThrIleValGlyGluGlySerLeuLysAlaGlyAlaAlaThrAlaIleGlyGlu；SEQIDNO.6：ThrAlaIleGluGlyAspSerAlaThrGlyLeuGluAlaAlaMetSerAlaIleGlyAla。下面是具体的实施例，用于进一步阐述本专利技术的技术方案及技术效果。实施例1马外周血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒，其特征在于，其包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽：SEQ ID NO.1：Glu Glu Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Leu Ala Ala Ala Gly Ile Gln Gly Ser Thr Ala；SEQ ID NO.2：Gln Glu Leu Glu Ser Glu Ala Gly Gly Ile Arg Val Thr Ala Ser Ala Arg Thr Gly Gly；SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Ile Glu Arg Arg Glu Thr Ala Ala Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala；SEQ ID NO.4：Glu Ala Met Asp Leu Leu Ser Glu Ala Glu Ala Thr Ile Ala Ser Thr Gly Gly Ala Ala；SEQ ID NO.5：Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Gly Ser Leu Lys Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ile Gly Glu；SEQ ID NO.6：Thr Ala Ile Glu Gly Asp Ser Ala Thr Gly Leu Glu Ala Ala Met Ser Ala Ile Gly Ala。...

【技术特征摘要】
1.一种马属隐孢子虫病的检测试剂盒，其特征在于，其包括氨基酸序列为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6所示的6条多肽：SEQIDNO.1：GluGluGlyAlaGluAlaAlaValLeuLeuAlaAlaAlaGlyIleGlnGlySerThrAla；SEQIDNO.2：GlnGluLeuGluSerGluAlaGlyGlyIleArgValThrAlaSerAlaArgThrGlyGly；SEQIDNO.3：ThrMetGlyAlaGlyIleGluArgArgGluThrAlaAlaProAlaThrAlaThrGlyAla；SEQIDNO.4：GluAlaMetAspLeuLeuSerGluAlaGluAlaThrIleAlaSerThrGlyGlyAlaAla；SEQIDNO.5：GlyLeuThrIleValGlyGluGlySerLeuLysAlaGlyAlaAlaThrAlaIleGlyGlu；SEQIDNO.6：ThrAlaIleGluGlyAspSerAlaThrGlyLeuGluAlaAlaMetSerAlaIleGlyAla。2.根据权利要求1所述的马属隐孢子虫病的检测试剂盒，其特征在于，在所述马属隐孢子虫病的...

【专利技术属性】
技术研发人员：边学静，殷玉芹，夏召莲，夏召亮，
申请(专利权)人：边学静，殷玉芹，夏召莲，夏召亮，
类型：发明
国别省市：广东,44