一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶及其制备方法；包括两性离子聚合物接枝纳米介质的制备和以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法：将聚(马来酸酐‑alt‑1‑十八碳烯)与N,N‑二甲基乙二胺的开环反应产物p(MAO‑DMEA)接枝到二氧化硅纳米粒子表面，得到两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs‑p(MAO‑DMEA)；以SNPs‑p(MAO‑DMEA)为载体，通过表面羧基的活化，将酶与载体共价结合，制得以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶。本发明专利技术制备方法简单、反应条件温和，易于操作，并以性能优良的两性离子聚合物为修饰剂，有利于获得高活性和稳定性的固定化酶。

Immobilized enzyme with zwitterionic polymer grafted nano medium as carrier and preparation method thereof

The present invention relates to an immobilized enzyme using amphoteric polymer grafted nano-media and its preparation method, including the preparation of amphoteric polymer grafted nano-media and the preparation method of immobilized enzyme using amphoteric polymer grafted nano-media: poly (maleic anhydride 1_octadecane) and N, Amphoteric polymer grafted onto silica nanoparticles was prepared by grafting P (MAO DMEA), an open ring reaction product of N_dimethylethylenediamine, onto the surface of silica nanoparticles. Immobilized enzyme with nanomaterials as carrier. The preparation method of the invention is simple, the reaction conditions are mild, and the operation is easy. The zwitterionic polymer with excellent performance is used as modifier to obtain the immobilized enzyme with high activity and stability.

【技术实现步骤摘要】
一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶及其制备方法
本专利技术涉及一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶及其制备方法，属于固定化酶

技术介绍
酶作为生物催化剂，具有催化效率高、底物专一性强、反应条件温和、催化活性调节方便等优点，已经广泛应用于化学合成、制药科学、食品加工和传感器技术等领域。然而，游离酶价格昂贵、稳定性差、难于分离回收再利用，这些固有的缺陷限制了其应用。为了解决上述问题，固定化技术被提出并得到快速发展。目前，酶的固定化方法主要有吸附法、共价结合法、交联法、包埋法等。这四种固定化方法各有千秋，一般根据选用的载体性质和酶结构特点选择适宜的固定方法。此外，载体的选择对固定化酶的性能也尤为重要，载体与酶的相互作用对酶的稳定性和动力学有明显的影响。在各类载体中，纳米结构材料由于具有比表面积大、表面反应活性高、机械强度好等优点而受到越来越多的关注。各种纳米材料如纳米纤维、碳纳米管、纤维素纳米晶体和纳米粒子等已经被用于酶的固定化研究。但是，纳米材料仍然存在一些缺陷，比如一些纳米材料生物相容性低，易导致表面结合酶快速变性、活性急剧降低。因此，通过表面修饰技术在载体表面引入亲水性物质增加载体的生物相容性是必须的。两性离子聚合物同时含有阴、阳离子基团，能够结合大量水分子，形成水化层。这种基于静电相互作用的水化层赋予两性离子材料良好的生物相容性和抗非特异性蛋白吸附性能。而且两性离子聚合物已经被证明能够维持蛋白质的三维空间结构、保持蛋白质的生物活性和稳定性。虽然一些研究者已经探索了两性离子化合物对酶活性和稳定性的影响，但是鲜少有涉及在两性离子聚合物接枝的纳米材料上共价固定酶的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有固定化酶所用载体材料生物相容性差、制备过程复杂等问题提供一种以两性离子聚合物接枝纳米介质作为固定化载体在制备固定化酶中的应用。本专利技术的目的还在于提供一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法。本专利技术制备方法简单、反应条件温和，易于操作，并以性能优良的两性离子聚合物为修饰剂，有利于获得高活性和稳定性的固定化酶。本专利技术的技术方案概述如下：一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶；其结构式如下：本专利技术的以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法，其特征是步骤如下：1)两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法：将聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(MAO)与N,N-二甲基乙二胺(DMEA)的开环反应产物p(MAO-DMEA)接枝到二氧化硅纳米粒子表面，得到两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-p(MAO-DMEA)；2)以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法：以SNPs-p(MAO-DMEA)为载体，通过表面羧基的活化，将酶与载体共价结合，制得以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶。本专利技术所述两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法，其特征是步骤如下：1)以四氢呋喃为溶剂，以聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)和N，N-二甲基乙二胺为原料，通过二者的开环反应合成两性离子聚合物p(MAO-DMEA)；2)利用氨丙基三乙氧基硅烷处理平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子SNPs-NH2；将p(MAO-DMEA)溶解在氯仿溶液中，配成浓度为17.5-75mg/mL的溶液，加入二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，DCC和NHS的浓度分别为12.5-53mg/mL和7.02-29.6mg/mL，对p(MAO-DMEA)表面羧基进行活化，然后加入上述氨基化的二氧化硅纳米粒子SNPs-NH2，置于20-30℃的恒温水浴摇床中振荡，反应结束后离心分离并依次用DMF、乙醇、去离子水清洗，得到两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-p(MAO-DMEA)；结构式如下：所述p(MAO-DMEA)与纳米粒子的质量比为0.71～2.88:1。上述步骤2)中所述的活化时间为1-2h。上述步骤2)中所述的水浴摇床振荡是以120-200rpm震荡12-20h。上述步骤2)中所述的离心速率是8000-10000rpm。本专利技术的以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法，其步骤如下1)将两性离子聚合物接枝纳米介质加入到MES缓冲液中，配成浓度为22-29mg/mL的悬浮液；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，使得悬浮液中EDC和NHS的浓度分别为40-60mg/mL和12-18mg/mL，室温下振荡反应，活化后离心弃上清并用磷酸缓冲液对活化的纳米介质进行清洗以除去未反应的EDC、NHS及副产物，得到活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质；2)将目标酶溶解于磷酸缓冲液中，高速冷冻离心收集上层酶溶液，除去不溶物，得到目标酶溶液；3)将步骤1)中活化后的两性离子聚合物接枝纳米介质加入到磷酸缓冲液中，再与目标酶溶液混合，使悬浮液中目标酶蛋白的浓度为0.09-0.89mg/mL，然后置于4-10℃恒温空气浴摇床中振荡反应，使目标酶固定在两性离子聚合物改性载体上，反应结束后洗涤、8000-9000rpm冷冻离心，得到以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶。上述步骤1)中室温下振荡反应30-60min；离心速率为8000-9000rpm。上述步骤3)中空气浴摇床中振荡条件为：速率是100-170rpm下反应10-20h。本专利技术的目标酶包括皱褶假丝酵母脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶等。本专利技术利用纳米介质表面接枝两性离子聚合物，实现酶分子的三维空间固定，具有以下优点和有益效果：1)纳米介质表面接枝的两性离子聚合物为酶的固定提供大量官能基团的同时也营造了一个生物相容性好的环境，有利于降低表面结合酶的活性损失、提高酶的稳定性；2)与聚阳离子或聚阴离子化合物修饰的载体材料相比，本专利技术所述的两性离子聚合物接枝的纳米介质表面同时含有阴、阳离子基团，整体呈电中性，对酶蛋白的作用力小，有利于维持酶分子构象的稳定，增加酶的催化活性；3)本专利技术所述的两性离子聚合物p(MAO-DMEA)不仅含有亲水性基团，还带有一疏水侧链，其可以与酶蛋白的疏水表面结合，改善酶蛋白表面的水化程度，提高酶分子的稳定性；4)本专利技术以两性离子聚合物接枝纳米介质作为固定化酶载体，采用碳二亚胺法活化载体，通过共价键的形式将酶连结到载体表面，酶与载体结合牢固，不易脱落，催化效果持久；5)本专利技术所述固定化酶的制备过程反应条件温和，工艺简单，成本低廉，所得固定化酶催化活性高、对底物的亲和力强，稳定性和反复使用性好。附图说明图1为不同温度下固定化酶对游离酶的相对比活(RSA)。图2为固定化酶与游离酶的pH稳定性图。图3为以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化CRL酶的重复使用性。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术提供的方法予以进一步的说明，但此处所描述的具体实施例是仅用于解释、而不以任何方式限制本专利技术。本专利技术将聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(MAO)与N,N-二甲基乙二胺(DMEA)的开环反应产物p(MAO-DMEA)接枝到二氧化硅纳米粒子表面，得到两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-p(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶；其结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶；其结构式如下：2.权利要求1的两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法，其特征是步骤如下：1)两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法：将聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(MAO)与N,N-二甲基乙二胺(DMEA)的开环反应产物p(MAO-DMEA)接枝到二氧化硅纳米粒子表面，得到两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-p(MAO-DMEA)；2)以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制备方法：以SNPs-p(MAO-DMEA)为载体，通过表面羧基的活化，将酶与载体共价结合，制得以两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶。3.如权利要求2所述的方法，其特征是两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法步骤如下：1)以四氢呋喃为溶剂，以聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)和N，N-二甲基乙二胺为原料，通过二者的开环反应合成两性离子聚合物p(MAO-DMEA)；2)利用氨丙基三乙氧基硅烷处理平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子SNPs-NH2；将p(MAO-DMEA)溶解在氯仿溶液中，配成浓度为17.5-75mg/mL的溶液，加入二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，DCC和NHS的浓度分别为12.5-53mg/mL和7.02-29.6mg/mL，对p(MAO-DMEA)表面羧基进行活化，然后加入上述氨基化的二氧化硅纳米粒子SNPs-NH2，置于20-30℃的恒温水浴摇床中振荡，反应结束后离心分离并依次用DMF、乙醇、去离子水清洗，得到两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-p(MAO-DMEA)；结构式如下：4.如权利要求3所述的方法，其特征是所述p(MAO-DMEA)与纳米粒子的质量比为...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙彦，张春玉，余林玲，董晓燕，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12