一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法及生产β-丙氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶的方法。所述方法步骤如下：配置L‑天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，活化树脂交联固化，得固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶。本发明专利技术还涉及一种生产β‑丙氨酸的方法，采用固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶为酶源制备而得。通过利用本发明专利技术获得的固定化酶进行生产获得的产物纯度高，容易分离；因此本发明专利技术在β‑丙氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化前景。

Method for immobilized L- aspartate alpha decarboxylase and method for producing beta alanine

The invention relates to a method for immobilizing L aspartate alpha decarboxylase. The steps of the method are as follows: the buffer solution of L_aspartic acid alpha decarboxylase is disposed, the activation resin is crosslinked and solidified, and the immobilized L_aspartic acid alpha decarboxylase is obtained. The invention also relates to a method for producing beta alanine, which is prepared by using immobilized L aspartate alpha decarboxylase as enzyme source. The product obtained by using the immobilized enzyme obtained by the invention has high purity and is easy to be separated; therefore, the invention has good industrialization prospect in the industrial production field of beta alanine.

【技术实现步骤摘要】
一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法及生产β-丙氨酸的方法
本专利技术涉及一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，还涉及一种生产β-丙氨酸的方法，属于生物技术生产氨基酸的

技术介绍
β-丙氨酸是天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，广泛应用于医药、食品等领域；在医药产品方面主要用于合成泛酸、泛酸钙、肌肽、巴柳氮和帕米磷酸钠；在食品方面主要用于食品的营养添加剂。最早生产β-丙氨酸是主要依靠化学合成法，但是随着对微生物法生产β-丙氨酸研究的深入，这种方法已经走向实用并处于主导地位。微生物法可以分为发酵法、微生物转化法和酶法合成法。其中酶法合成法是利用微生物泛酸生物合成途径的关键酶L-天冬氨酸α-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱α位羧基生成β-丙氨酸。酶法生产β-丙氨酸具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少以及精制操作容易等优点，是一种高效、廉价生产β-丙氨酸的方法。2006年，郭恒华等报道了利用重组大肠杆菌菌株生产β-丙氨酸的方法。该技术以工程菌为酶源，不利于后续的分离纯化，并且不能重复利用，成本相对较高。焦庆才(CN107012180A)等利用多酶偶联转化马来酸制备β-丙氨酸的方法；该技术采用多酶体系偶联催化，各种酶的最佳催化条件不同，导致酶活利用率低，底物转化不彻底。因此，有必要提出有效的技术方案，解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术成本高、底物反应不彻底的不足，提供一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法及一种生产β-丙氨酸的方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，所述方法步骤如下：①配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000U/g的L-天冬氨酸α脱羧酶用质量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液溶解，再溶解温度为4～10℃，制备出L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液；所述L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液中L-天冬氨酸α脱羧酶活力为50U/mL；②交联固化：将活化树脂置于反应器中，温度保持在0～10℃条件下，加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60min；待活化树脂充分吸附酶并牢固结合后，加入戊二醛溶液，室温下搅拌1～2h，过滤收集固定化酶，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂；在-80℃条件下冷冻干燥24h，4℃冰箱保藏备用；所述活化树脂的质量与L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1g:(50～100)ml；活化树脂的质量与戊二醛溶液的体积比为1g:(5～10)ml。优选地，所述活化树脂的制备方法包括：将树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，得初级活化树脂；将初级活化树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后将过滤洗涤后的树脂按树脂：NaCO3：去离子水＝1:0.2～0.9:30～100的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至9～12，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h，得到活化树脂。优选地，所述戊二醛溶液中戊二醛体积分数5％～10％。优选地，所述树脂为LKZ128树脂、AB-8和ES-2树脂中的一种。优选地，所述固化剂为溴化氰，加入量为树脂质量的0.5％～1％。本专利技术提供一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶，采用上述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法制备得到的。本专利技术提供一种生产β-丙氨酸的方法，步骤包括：采用权利要求6所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶为酶源，以100g/L的L-天冬氨酸为初始底物浓度，进行酶法转化反应，所述酶法转化反应条件为：在35℃至50℃下，流加L-天冬氨酸稳定pH为7，经酶法转化反应3-7h后，经过滤除去固定化酶，上清液加入活性炭脱色，再分离获得β-丙氨酸粗品；将β-丙氨酸粗品经纯化后得到β-丙氨酸纯品。优选地，所述酶法转化条件为：转化温度为37℃，转化时间为5h。优选地，所述酶法转化反应中固定化酶的加入量为10至80mL,底物L-天冬氨酸的加入量为10至80g。优选地，所述纯化方法为：将所述β-丙氨酸粗品经超滤膜过滤后减压浓缩，将浓缩物缓慢搅拌进行降温，析出白色晶体，减压抽滤，经乙醇洗涤，干燥获得β-丙氨酸。有益效果：本专利技术以固定化的L-天冬氨酸α脱羧酶为酶源，以L-天冬氨酸为底物，经酶法转化反应生产β-丙氨酸；由于选用大孔吸附树脂作为优选载体，同时在固定化过程中采用固化剂及交联剂进行特殊处理，使酶和树脂更充分的接触，可以有效避免酶固定化过程中的聚集问题；并且本专利技术获得的固定化酶的使用半衰期长，4℃条件下的保存半衰期最长可达100天，可重复使用70次以上，且固定化酶的活力回收可达70％；另外，通过利用本专利技术获得的固定化酶进行生产获得的产物纯度高，容易分离；因此本专利技术在β-丙氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化前景。附图说明图1是催化条件的优化关系图；A:反应温度与L-天冬氨酸转化率的关系；B：反应时间与L-天冬氨酸转化率的关系；C：底物L-天冬氨酸与L-天冬氨酸转化率的关系；D：固定化酶体积与L-天冬氨酸转化率的关系；图2是HPLC法检测反应液中以及纯化后的β-丙氨酸；在图2中，14.304min为β-丙氨酸出峰时间，10.839min，18.110min和29.744min为溶剂峰。具体实施方式本专利技术涉及一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，步骤包括：(1)配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000U/g的L-天冬氨酸α脱羧酶(EC号4.1.1.11)产品先用质量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液溶解，再溶解时调节温度为4～10℃，用NaOH调节pH为6～8；然后用1.0～1.5微米的微孔滤膜过滤，收集滤液，制备出L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，其中所述L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液中L-天冬氨酸α脱羧酶活力为50U/mL；(2)交联固化：将活化树脂置于反应器中，温度保持在0～10℃条件下，加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60min；待活化树脂充分吸附酶并牢固结合后，加入戊二醛溶液，室温下搅拌1～2h，过滤收集固定化酶，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂；在-80℃条件下冷冻干燥24h，4℃冰箱保藏备用；所述活化树脂的质量与L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1g:(50～100)ml；活化树脂的质量与戊二醛溶液的体积比为1g:(5～10)ml。作为本专利技术的一个实施例，所述活化树脂的制备方法包括：将树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，得初级活化树脂；将初级活化树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后将过滤洗涤后的树脂按树脂：NaCO3：去离子水＝1:0.2～0.9:30～100的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至9～12，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h，得到活化树脂。下面采用具体实施例进一步详细阐述本专利技术所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法。实施例1LKZ128树脂固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，①配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：①配置L‑天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000U/g的L‑天冬氨酸α脱羧酶用质量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液溶解，再溶解温度为4～10℃，制备出L‑天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液；所述L‑天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液中L‑天冬氨酸α脱羧酶活力为50U/mL；②交联固化：将活化树脂置于反应器中，温度保持在0～10℃条件下，加入L‑天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60min；待活化树脂充分吸附酶并牢固结合后，加入戊二醛溶液，室温下搅拌1～2h，过滤收集固定化酶，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L‑天冬氨酸α脱羧酶树脂；在‑80℃条件下冷冻干燥24h，4℃冰箱保藏备用；所述活化树脂的质量与L‑天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1g:(50～100)ml；活化树脂的质量与戊二醛溶液的体积比为1g:(5～10)ml。

【技术特征摘要】
1.一种固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：①配置L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液：将活性1000U/g～10000U/g的L-天冬氨酸α脱羧酶用质量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液溶解，再溶解温度为4～10℃，制备出L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液；所述L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液中L-天冬氨酸α脱羧酶活力为50U/mL；②交联固化：将活化树脂置于反应器中，温度保持在0～10℃条件下，加入L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液，在搅拌下处理30～60min；待活化树脂充分吸附酶并牢固结合后，加入戊二醛溶液，室温下搅拌1～2h，过滤收集固定化酶，用10倍体积的去离子水洗涤3次，得固定化L-天冬氨酸α脱羧酶树脂；在-80℃条件下冷冻干燥24h，4℃冰箱保藏备用；所述活化树脂的质量与L-天冬氨酸α脱羧酶缓冲溶液的体积比为1g:(50～100)ml；活化树脂的质量与戊二醛溶液的体积比为1g:(5～10)ml。2.如权利要求1所述的固定化L-天冬氨酸α脱羧酶的方法，其特征在于，所述活化树脂的制备方法包括：将树脂用95％乙醇浸泡振荡洗涤4h，用4％HCl振荡洗涤1h，4％NaOH振荡洗涤1h，得初级活化树脂；将初级活化树脂与浓度为10％的碳酸钠溶液浸泡12h后，过滤，过滤出的树脂用去离子水洗涤，然后将过滤洗涤后的树脂按树脂：NaCO3：去离子水＝1:0.2～0.9:30～100的质量比配成混合液，用NaOH溶液调节混合液pH至9～12，搅拌条件下降温至-5℃以下，加入固化剂保温1h，得到活化树脂。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东阳，于添池，刘树立，陈正，
申请(专利权)人：王东阳，
类型：发明
国别省市：山东,37