一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体免疫细胞表面表达抗PD‑L1嵌合抗原受体，所述抗PD‑L1嵌合抗原受体的胞外抗原结合区包括PD‑1胞外段及PD‑1信号肽。本发明专利技术通过在嵌合抗原受体免疫细胞表面表达抗PD‑L1嵌合抗原受体，避免了因免疫细胞表面PD‑1与肿瘤细胞表面PD‑L1结合而引发的免疫细胞枯竭，实现了将PD‑1通路引发的抑制信号转变为免疫细胞激活信号，显著增强了嵌合抗原受体免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

Chimeric antigen receptor immunoreactive cell and preparation method and application thereof

The invention provides a chimeric antigen receptor immune cell, a preparation method and an application thereof. The chimeric antigen receptor immune cell expresses an anti-PD_L1 chimeric antigen receptor on the surface of the chimeric antigen receptor immune cell. The extracellular antigen binding region of the anti-PD_L1 chimeric antigen receptor includes the extracellular segment of PD_1 and the PD_1 signal peptide. By expressing the anti-PD_L1 chimeric antigen receptor on the surface of the immune cells of the chimeric antigen receptor, the invention avoids the exhaustion of the immune cells caused by the binding of the immune cell surface PD_1 with the tumor cell surface PD_L1, and realizes the transformation of the inhibition signal induced by the PD_1 pathway into the activation signal of the immune cells, thereby significantly enhancing the chimeric anti-PD_1. The ability of the original receptor immune cells to kill tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，CAR-T)免疫疗法是近年来热门的血液性肿瘤的免疫治疗方法，主要通过嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)进行癌细胞抗原的识别和杀伤。近年来，CAR-T免疫疗法在多个临床试验中取得极佳的治疗效果。报道称，经过CAR-T免疫疗法，90％的急性淋巴细胞白血病患者得到完全缓解(S.L.Maudeetal.ChimericantigenreceptorTcellsforsustainedremissionsinleukemia.Engl.J.Med.,371,1507-1517(2014))。靶向CD19抗原治疗B淋巴细胞白血病和淋巴瘤的成功振奋人心，2017年美国食品药品监督局相继批准诺华和吉利的治疗白血病CAR-T细胞产品上市。肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤，发病率和死亡率居所有恶性肿瘤之首，近50年来已成为全球范围内最严重的癌症类型之一。非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer，NSCLC)占肺癌总人数的85％，目前针对非小细胞肺癌的治疗方案主要为手术、放疗、化疗、中药治疗和靶向治疗。我国还未能全面普及居民的定期肿瘤筛查，约80％的肺癌患者在确诊时已进入晚期，错过了最佳治疗期，治愈率低；此外，非小细胞肺癌对于放疗、化疗的敏感性差，治疗效果欠佳。针对EGFR、ALK等基因突变的靶向性治疗只能用于存在上述基因突变的肺癌患者，受众人数少，且患者容易产生耐药性。因此，非小细胞肺癌需要更为强效的治疗手段。肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是一种常见的恶性肿瘤，因其死亡率高、病程短，被称为“癌症之王”。治疗肝癌最有效的方法是手术，对于无法进行手术的患者，可采用区域化疗栓塞和放射介入治疗。尽管如此，肝癌患者的5年生存率仅10％，探索更为有效的治疗手段迫在眉睫。CAR-T免疫疗法在治疗白血病方面的成功，让我们自然联想到将其应用于NSCLC和HCC的治疗。应用CAR-T免疫疗法治疗NSCLC和HCC，可以采用的肿瘤细胞表面抗原包括间皮素(Mesothelin，meso)、前列腺干细胞抗原(prostatestemcellantigen，PSCA)、粘蛋白(mucin1，MUC1)、人类表皮生长因子受体2(humanepidermalreceptor2，HER2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican3，GPC3)。目前已开展多项针对上述靶点的CAR-T免疫疗法临床试验，然而未取得有效进展，主要是因为实体肿瘤细胞和免疫细胞表面会表达细胞程序性死亡配体1(programmingdeathligand1，PD-L1)和细胞程序性死亡配体2(programmingdeathligand2，PD-L2)，PD-L1和PD-L2会与CAR-T细胞表面的细胞程序性死亡受体1(programmingdeath1，PD-1)结合，引发胞内抑制性信号通路，导致CAR-T细胞枯竭，失去对肿瘤的杀伤能力。针对PD-1通路的抗体药物在实体肿瘤的治疗过程中取得了瞩目效果也印证了这一理论。然而单纯服用针对PD-1通路的抗体药物是依靠浸润至肿瘤微环境中的T细胞(TumorinfiltrationTcell，TIL)来杀伤肿瘤细胞，TIL的数量有限，难以获得较好的治疗效果，另外，抗体药物治疗方案需要持续服药，停止服药后，T细胞会立即枯竭，该方案无法从根本上逆转T细胞的命运。因此，对CAR-T进行改造，使其可以特异性识别和杀伤肿瘤细胞，具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体免疫细胞将PD-1通路引发的抑制性信号转变为激活信号，显著增强了嵌合抗原受体免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表面表达抗PD-L1嵌合抗原受体，所述抗PD-L1嵌合抗原受体的胞外抗原结合区包括PD-1胞外段及PD-1信号肽。本专利技术中，通过在嵌合抗原受体免疫细胞表面表达抗PD-L1嵌合抗原受体，避免了因免疫细胞表面PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1结合而引发的免疫细胞凋亡，实现了将PD-1通路引发的抑制信号转变为免疫细胞激活信号，从根本上逆转了嵌合抗原受体免疫细胞在实体肿瘤中的枯竭状态，显著增强了嵌合抗原受体免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。本专利技术中，采用PD-1作为抗PD-L1嵌合抗原受体的胞外抗原结合区，对PD-L1亲和力适中，不仅保证了嵌合抗原受体免疫细胞对肿瘤细胞的有效杀伤，而且减小了嵌合抗原受体免疫细胞对正常细胞的副作用。根据本专利技术，PD-L1抗体具有结合PD-L1的作用，可以作为抗PD-L1嵌合抗原受体的胞外抗原结合区，但是PD-L1抗体为人工抗体，与PD-1相比，对PD-L1亲和力强，不仅对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用，而且对正常细胞具有一定的杀伤作用，制备的嵌合抗原受体免疫细胞对正常细胞具有明显的副作用。优选地，所述PD-1胞外段的核酸序列如SEQIDNO.1所示；所述SEQIDNO.1所示的核酸序列为：ccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtg.优选地，所述PD-1信号肽的核酸序列如SEQIDNO.2所示；所述SEQIDNO.2所示的核酸序列为：atgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcgg.优选地，所述抗PD-L1嵌合抗原受体的跨膜区包括PD-1跨膜段。优选地，所述PD-1跨膜段的核酸序列如SEQIDNO.3所示；所述SEQIDNO.3所示的核酸序列为：gttggtgtcgtgggcggcctgctgggcagcctggtgctgctagtctgggtcctggccgtcatc.优选地，所述抗PD-L1嵌合抗原受体的胞内信号转导区包括Toll样受体1或Toll样受体2，优选为Toll样受体2。T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表面表达抗PD‑L1嵌合抗原受体，所述抗PD‑L1嵌合抗原受体的胞外抗原结合区包括PD‑1胞外段及PD‑1信号肽。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表面表达抗PD-L1嵌合抗原受体，所述抗PD-L1嵌合抗原受体的胞外抗原结合区包括PD-1胞外段及PD-1信号肽。2.根据权利要1所述嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述PD-1胞外段的核酸序列如SEQIDNO.1所示；优选地，所述PD-1信号肽的核酸序列如SEQIDNO.2所示；优选地，所述抗PD-L1嵌合抗原受体的跨膜区包括PD-1跨膜段；优选地，所述PD-1跨膜段的核酸序列如SEQIDNO.3所示；优选地，所述抗PD-L1嵌合抗原受体的胞内信号转导区包括Toll样受体1或Toll样受体2，优选为Toll样受体2；优选地，所述Toll样受体1的核酸序列如SEQIDNO.4所示；优选地，所述Toll样受体2的核酸序列如SEQIDNO.5所示；优选地，所述抗PD-L1嵌合抗原受体的胞内信号转导区还包括41BB；优选地，所述41BB的核酸序列如SEQIDNO.6所示。3.根据权利要求1或2所述嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述抗PD-L1嵌合抗原受体由PD-1信号肽、PD-1、41BB和Toll样受体2串联组成；优选地，所述抗PD-L1嵌合抗原受体为：PD-1信号肽-PD-1-41BB-Toll2。4.根据权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表面还表达辅助抗PD-L1嵌合抗原受体的辅助嵌合抗原受体；优选地，所述辅助嵌合抗原受体包括抗Mesothelin嵌合抗原受体、抗PSCA嵌合抗原受体、抗MUC1嵌合抗原受体、抗HER2嵌合抗原受体或抗GPC3嵌合抗原受体中的任意一种；优选地，所述抗Mesothelin嵌合抗原受体的胞外抗原结合区包括Mesothelin单链可变区；优选地，所述Mesothelin单链可变区的核酸序列如SEQIDNO.7所示；优选地，所述抗PSCA嵌合抗原受体的胞外抗原结合区包括PSCA单链可变区；优选地，所述PSCA单链可变区的核酸序列如SEQIDNO.8所示；优选地，所述抗MUC1嵌合抗原受体的胞外抗原结合区包括MUC1单链可变区；优选地，所述MUC1单链可变区的核酸序列如SEQIDNO.9所示；优选地，所述抗HER2嵌合抗原受体的胞外抗原结合区包括HER2单链可变区；优选地，所述HER2单链可变区的核酸序列如SEQIDNO.10所示；优选地，所述抗GPC3嵌合抗原受体的胞外抗原结合区包括GPC3单链可变区；优选地，所述GPC3单链可变区的核酸序列如SEQIDNO.11所示；优选地，所述辅助嵌合抗原受体的信号肽为GM-CSF信号肽；优选地，所述GM-CSF信号肽的核酸序列如SEQIDNO.12所示；优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏，秦乐，魏新茹，赵若聪，程琳，姚瑶，
申请(专利权)人：深圳市体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44