用于增强生产的RNA相关酶的修饰制造技术

本发明专利技术尤其提供了使用SUMO‑鸟苷酰转移酶融合蛋白用于大规模生产加帽的mRNA的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增强生产的RNA相关酶的修饰相关专利申请本专利申请要求于2015年10月14日提交的美国临时申请序列号62/241,350的优先权，所述美国临时申请的公开内容在此以引用的方式并入。序列表本说明书参考了于2016年10月14日作为命名为“SL_SHR-1187WO”的.txt文件电子提交的序列表。该.txt文件于2016年10月14日生成，并且大小为28,402字节。序列表的全部内容以引用的方式并入本文。
技术介绍
信使RNA(“mRNA”)疗法正在成为用于治疗各种疾病的越来越重要的方法。有效的mRNA疗法需要将mRNA有效递送给患者，以及由mRNA编码的蛋白质在患者体内的有效产生。为了最佳化mRNA递送和体内蛋白质产生，在构建体的5'末端处通常需要适当的帽，所述帽保护mRNA免于降解并且促进成功的蛋白质翻译。因此，能够给mRNA加帽的酶的大规模生产对于产生用于治疗应用的mRNA特别重要。
技术实现思路
本专利技术提供了用于有效生产能够给mRNA加帽的酶的改进方法。本专利技术部分基于下述令人惊讶的发现：用SUMO标签修饰鸟苷酰转移酶(GT)使得以产生用于治疗应用的加帽的mRNA所需的大规模生产GT成为可能。因此，在一个方面，本专利技术提供了产生加帽的RNA或RNA类似物寡核苷酸的方法，其中融合蛋白促进将鸟苷酰分子转移至RNA或RNA类似物寡核苷酸的5’末端和使鸟苷酰分子甲基化的步骤。在一些实施例中，融合蛋白包含鸟苷酰转移酶和小泛素样分子(SUMO)蛋白。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶包含SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，并且SUMO蛋白包含SEQIDNO:5。在一些实施例中，融合蛋白包含SEQIDNO:8和SEQIDNO:7。在一些实施例中，RNA或RNA类似物寡核苷酸的一个末端是5'末端。在一些实施例中，相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。在另一个方面，本专利技术提供了融合蛋白，其中融合蛋白包含鸟苷酰转移酶和小泛素样分子(SUMO)蛋白。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶包含SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，并且SUMO蛋白包含SEQIDNO:5。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶包含大亚基和小亚基。在一些实施例中，SUMO蛋白与大亚基共价连接且共表达。在一些实施例中，相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。在另一个方面，本专利技术提供了编码包含鸟苷酰转移酶蛋白和小泛素样分子(SUMO)蛋白的融合蛋白的载体。在一些实施例中，载体包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。在一些实施例中，载体包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。在一些实施例中，载体包含SEQIDNO:4和SEQIDNO:3。在另一个方面，本专利技术提供了通过发酵生产鸟苷酰转移酶的方法，所述方法包括：a)在发酵培养基中培养用至少一种重组核酸分子转化的微生物，所述重组核酸分子包含编码鸟苷酰转移酶的核酸序列，所述鸟苷酰转移酶具有与SEQIDNO:6和SEQIDNO:7至少90％相同的氨基酸序列；和b)收集由培养步骤产生的产物。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶包含鸟苷酰转移酶融合蛋白。在一些实施例中，相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，鸟苷酰转移酶融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶融合蛋白包含小泛素样分子(SUMO)蛋白。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶融合蛋白包含SEQIDNO:8。在一些实施例中，SUMO蛋白通过共价键与鸟苷酰转移酶结合。在一些实施例中，共价键在SUMO蛋白和鸟苷酰转移酶的大亚基之间。在一些实施例中，发酵培养基选自TerrificBroth、Cinnabar、2xYT和LB。在一些实施例中，微生物是细菌。在一些实施例中，编码鸟苷酰转移酶的核酸序列与SEQIDNO:2和SEQIDNO:3至少90％相同。在一些实施例中，重组核酸分子还包含编码小泛素样分子(SUMO)蛋白的核酸序列。在一些实施例中，编码小泛素样分子(SUMO)蛋白的核酸序列与SEQIDNO:1至少90％相同。在一些实施例中，产物是鸟苷酰转移酶。在一些实施例中，产物是包含鸟苷酰转移酶融合蛋白的鸟苷酰转移酶。在一些实施例中，鸟苷酰转移酶融合蛋白还包含小泛素样分子(SUMO)蛋白。附图说明这些附图用于说明的目的并且决不是限制性的。图1A和1B是本专利技术的各种实施例中存在的示例性mRNA加帽结构的图解。图2证实了与经由摇瓶方法产生的GT蛋白的产率相比，通过发酵产生的可溶性SUMO-GT蛋白的示例性产率。定义为了使本专利技术更容易理解，首先定义了某些术语。下述术语和其他术语的另外定义在说明书自始至终得到阐述。大约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值类似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”指在所述参考值的任一方向上(大于或小于)落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的一系列值，除非另有说明或从上下文另外显而易见(除非当这种数目超过可能值的100％时)。分批培养：如本文使用的，术语“分批培养”指培养细胞的方法，其中最终用于培养细胞的所有组分，包括培养基(参见下文“培养基”的定义)以及细胞本身，在培养过程开始时提供。因此，分批培养通常指允许从接种进行到结束的培养，而无需用新鲜培养基给培养的细胞重新补料。分批培养通常在某个点停止，并且收获培养基中的细胞和/或组分且任选进行纯化。生物活性的：如本文使用的，短语“生物活性的”指在生物系统(例如细胞培养物、生物等)中具有活性的任何物质的特征。例如，当被施用于生物时，对该生物具有生物作用的物质被视为生物活性的。生物活性还可通过体外测定(例如体外酶促测定，如硫酸盐释放测定)来测定。在特定实施例中，当蛋白质或多肽是生物活性的时，共享蛋白质或多肽的至少一种生物活性的该蛋白质或多肽的一部分通常称为“生物活性”部分。在一些实施例中，蛋白质由细胞培养系统产生和/或纯化，所述细胞培养系统当施用于受试者时展示生物活性。在一些实施例中，蛋白质需要进一步加工以便成为生物活性的。在一些实施例中，蛋白质需要翻译后修饰，例如但不限于糖基化(例如唾液酸化)、法尼基化、切割、折叠、甲酰甘氨酸转换及其组合，以便成为生物活性的。在一些实施例中，作为前体形式(proform)(即未成熟形式)产生的蛋白质可能需要另外的修饰，以成为生物活性的。生物反应器：如本文使用的，术语“生物反应器”指用于宿主细胞培养物生长的容器。生物反应器可具有任何尺寸，只要它可用于培养哺乳动物细胞。通常，生物反应器为至少1升，并且可为10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,0000升或更多，或者之间的任何体积。生物反应器的内部条件，包括但不限于pH、摩尔渗透压浓度、CO2饱和度、O2饱和度、温度及其组合，通常在培养期间加以控制。生物反应器可由任何材料组成，所述材料适合于在本专利技术的培养条件下将细胞保持在培养基中，包括玻璃、塑料或金属。在一些本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生加帽的RNA或RNA类似物寡核苷酸的方法，其中融合蛋白促进将鸟苷酰分子转移至所述RNA或RNA类似物寡核苷酸的5’末端和使所述鸟苷酰分子甲基化的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.14 US 62/241,3501.一种产生加帽的RNA或RNA类似物寡核苷酸的方法，其中融合蛋白促进将鸟苷酰分子转移至所述RNA或RNA类似物寡核苷酸的5’末端和使所述鸟苷酰分子甲基化的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包含鸟苷酰转移酶和小泛素样分子(SUMO)蛋白。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述鸟苷酰转移酶包含SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，并且所述SUMO蛋白包含SEQIDNO:5。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:8和SEQIDNO:7。5.根据权利要求1所述的方法，其中相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，所述融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。6.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白包含鸟苷酰转移酶和小泛素样分子(SUMO)蛋白。7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述鸟苷酰转移酶包含SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，并且所述SUMO蛋白包含SEQIDNO:5。8.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述鸟苷酰转移酶包含大亚基和小亚基。9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述SUMO蛋白与所述大亚基共价连接且共表达。10.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中相对于野生型鸟苷酰转移酶蛋白，所述融合蛋白具有可比较的磷酸酶活性、鸟苷酰转移酶活性和甲基化活性。11.一种载体，所述载体编码包含鸟苷酰转移酶蛋白和小泛素样分子(SUMO)蛋白的融合蛋白。12.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。13.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。14.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQIDNO:4和SEQIDNO:3。15.一种通过发酵生...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·斯特拉克罗格，F·德罗莎，M·哈特莱因，
申请(专利权)人：川斯勒佰尔公司，
类型：发明
国别省市：美国,US