具有增加的NEP稳定性的控制释放CNP激动剂制造技术

本发明专利技术涉及控制释放CNP激动剂，其在体外NEP降解测定法中具有比相应的释放的CNP激动剂至少长5倍的降解半衰期，本发明专利技术还涉及包含所述控制释放CNP激动剂的药物组合物、它们的用途和治疗方法。

Controlled release CNP agonists with increased NEP stability

The invention relates to a controlled release CNP agonist, which has a degradation half-life at least five times longer than the corresponding release CNP agonist in the in vitro NEP degradation assay. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the controlled release CNP agonists, their uses and treatment methods.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增加的NEP稳定性的控制释放CNP激动剂本专利技术涉及控制释放CNP激动剂，其在体外NEP降解测定法中具有比相应的释放的CNP激动剂长至少5倍的降解半衰期，本专利技术还涉及包含所述控制释放CNP激动剂的药物组合物、它们的用途和治疗方法。软骨发育不全(ACH)是由FGFR3中的功能获得性突变引起的。CNP与其受体利尿钠肽受体B(NPR-B)的结合抑制FGFR3下游信号传导，并由此触发软骨内生长和骨骼过度生长，如在过表达CNP的小鼠和人中所观察到的那样。CNP在软骨中的过度产生或通过静脉内(iv)输注连续递送CNP使得软骨发育不全的小鼠的侏儒症正常化，这提示在超生理(supraphysiological)水平下施用CNP是治疗ACH的策略。然而，由于CNP-22半衰期短(静脉内施用后2min)，所以CNP作为治疗剂在儿科人群中具有挑战性，因为它需要连续输注。此外，由于CNP在皮下组织中广泛失活，所以需要静脉内输注。Potter(FEBSJournal278(2011)1808–1817)描述了CNP通过两种降解途径发生清除：受体介导的降解和胞外蛋白酶引起的降解。CNP通过中性内肽酶24.11(NEP)的作用被降解，通过利尿钠肽清除受体NPR-C从体循环中被除去，所述NPR-C结合CNP并使其沉积入溶酶体中，在溶酶体中CNP被降解。通过这些清除路径中的一个或两个减少降解将有助于延长CNP的半衰期。由于其活性位点空腔的大小有限，NEP优选识别小于约3kDa的底物。US8,377,884B2描述了CNP的变体，其任选地与PEG聚合物持久地缀合以增加对NEP裂解的抗性。然而，发现向野生型CNP添加PEG(甚至小至0.6kDa)也降低CNP活性，向CNP或其变体添加大于约2或3kDa的PEG以尺寸依赖性方式降低CNP功能活性。因此，连接大于2-3kDa的PEG分子以降低NEP降解伴随着活性的损失，这会降低这类分子的治疗潜力。除了对肽的活性产生负面影响之外，PEG或另一种大分子与CNP的缀合还可阻止向生长面的有效分布。Farnum等人(AnatRecADiscovMolCellEvolBiol.2006年1月；288(1):91–103)证明，分子从系统脉管系统到生长面的分布是尺寸依赖性的，小分子(至多10kDa)可以分布至生长面，而40kDa和更大的分子尺寸则阻止进入生长面。在TheAmericanJournalofHumanGenetics91,1108–1114中描述了产生NEP抗性CNP分子并使其能皮下施用的不同方法。BMN-111是修饰的重组人C-型利尿钠肽(CNP)，其中已添加17个氨基酸以形成39个氨基酸的CNP药理学类似物。BMN-111模拟CNP在生长面上的药理学活性，并且由于中性内肽酶(NEP)抗性具有延长的半衰期，其使得可以每天一次皮下(SC)施用。由于BMN-111是非天然存在的肽，所以与天然肽相比，诱导免疫应答的风险增加，并且如Martz在“sFGFRforachondroplasia”(SciBx,Biocentury2013年10月)中所述，在动物研究中已经观察到了对BMN-111免疫应答，其中存在不影响药物的药理学活性的抗体。然而，BMN-111仅具有20分钟的半衰期，其与每天一次给药时暴露于有效药物水平的时间短相关。为了增加对有效药物水平的暴露，可以增加具有CNP活性的药物的剂量。由于利尿钠肽是一族可影响血容量和血压的激素，所以剂量的增加可能与心血管不良作用相关。BMN-111在动物和人中的研究表明，随着剂量增加，动脉血压下降，心率增加。在健康志愿者中高达15μg/kg的BMN-111剂量与轻度低血压相关。因此，增加具有CNP活性的药物的剂量以增加药物暴露可能与不可接受的心血管副作用相关。因此，增加具有CNP活性的药物的剂量以增加药物暴露可能与不可接受的心血管副作用例如低血压相关。总之，需要更有效、更安全的CNP治疗方法。因此，本专利技术的一个目的是至少部分克服上述缺点。该目的通过控制释放CNP激动剂得以实现，其中所述控制释放CNP激动剂释放一种或多种CNP激动剂，并且其中在体外NEP降解测定法中所述控制释放CNP激动剂具有比相应的释放的CNP激动剂长至少5倍的降解半衰期。令人惊讶地发现，控制释放CNP激动剂的应用提供了有效的防止NEP降解的保护，这增加了CNP激动剂的半衰期。由于本专利技术的控制释放CNP激动剂也释放CNP激动剂，所以所述CNP激动剂能显示出其全部活性并且其对生长面的进入不受限制。在本专利技术中使用的术语具有如下含义。本文所用的术语“CNP激动剂”是指活化利尿钠肽受体B(NPR-B)且具有比CNP-22(SEQIDNO:1)的NPR-B活性高至多50-倍的EC50的任何化合物。本文所用的关于控制释放CNP激动剂和CNP激动剂的“EC50”是指引起半数最大cGMP产生的控制释放CNP激动剂和CNP激动剂浓度。控制释放CNP激动剂、释放的CNP激动剂和CNP-22的其EC50形式的NPR-B活性是如下测量的：培养在其细胞表面上表达NPR-B的NIH-3T3(鼠胚胎成纤维细胞系)细胞，将所述细胞分别与控制释放CNP激动剂、相应的释放的CNP激动剂或CNP-22一起孵育，用标准cGMP测定法测定细胞内第二信使cGMP的产生。具体地，该测定法如下进行：(1)将表达内源性NPR-B的鼠NIH-3T3细胞在含有5％FBS和5mM谷氨酰胺的DMEMF-12培养基中在37℃和5％CO2下培养；(2)对于每次测定，将50,000个细胞重新混悬于具有IBMX的DulbeccoPBS中，与控制释放CNP激动剂、相应的释放的CNP激动剂或CNP-22一起孵育；各自在不同的浓度下进行；(3)在37℃和5％CO2下孵育30min后，裂解细胞并测定cGMP水平；和(4)由所测定的cGMP水平生成EC50值。优选地，步骤(2)中的IBMX浓度优选为0.5mM。步骤(3)可以使用任何测定cGMP的测定法来进行，这是本领域技术人员公知的标准方法。优选地，步骤(3)用cGMPTR-FRET测定法进行，更优选地用来自Cisbio,Cat.No.62GM2PEB的cGMPTR-FRET测定法进行。本文所用的术语“CNP”是指所有CNP多肽，优选来自哺乳动物物种的CNP多肽，更优选来自人和哺乳动物物种的CNP多肽，更优选来自人和鼠物种的CNP多肽，以及它们的变体、类似物、直向同源物、同源物(homolog)和衍生物及其片段，其特征在于调节软骨生长面软骨细胞的生长、增殖和分化。优选地，术语“CNP”是指SEQIDNO:24的CNP多肽以及基本上显示相同生物学活性、即调节软骨生长面软骨细胞的生长、增殖和分化的其变体、同源物和衍生物。更优选地，术语“CNP”是指SEQIDNO:24的多肽。在另一个实施方案中，术语“CNP”是指SEQIDNO:20的多肽。在另一个实施方案中，术语“CNP”是指SEQIDNO:21的多肽。在另一个实施方案中，术语“CNP”是指SEQIDNO:22的多肽。在另一个优选的实施方案中，术语“CNP”是指SEQIDNO:23的多肽。在另一个实施方案中，术语“CNP”是指SEQIDNO:30的多肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂释放一种或多种CNP激动剂，并且其中所述的控制释放CNP激动剂在体外NEP降解测定法中具有比相应的释放的CNP激动剂长至少5倍的降解半衰期。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.08 EP 16150628.2;2016.07.13 EP 16179289.0;1.控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂释放一种或多种CNP激动剂，并且其中所述的控制释放CNP激动剂在体外NEP降解测定法中具有比相应的释放的CNP激动剂长至少5倍的降解半衰期。2.权利要求1的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂在生理条件下以至少6小时的释放半衰期释放至少一种CNP激动剂。3.权利要求1或2的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂优选包含选自小分子、天然产物、寡核苷酸、多肽和蛋白质的CNP激动剂。4.权利要求1-3中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的CNP激动剂是多肽。5.权利要求1-4中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的CNP激动剂是CNP。6.权利要求1-5中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂是水不溶性的。7.权利要求1-6中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂选自晶体、纳米粒、微粒、纳米球和微球。8.权利要求1-7中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放激动剂是包含至少一种CNP激动剂的囊泡，并且其中所述的囊泡是胶束、脂质体或聚合物囊泡。9.权利要求1-5中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂是水溶性的。10.权利要求1-5或9中任意一项的控制释放CNP激动剂，其中所述的控制释放CNP激动剂是式(Ia)或(Ib)的CNP激动剂前药：其中-D是CNP激动剂原子团；-L1-是可逆前药连接基原子团；-L2-是单化学键或间隔基原子团；-Z是水溶性载体原子团；x是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16的整数；且y是选自1、2、3、4和5的整数。11.药物组合物，其包含权利要求1-10中任意一项的控制释放CNP激动剂和至少一种赋形剂。12.权利要求1-10中任意一项的控制释放CNP激动剂或权利要求11的药物组合物，其用作药剂。13.权利要求12的控制释放CNP激动剂或药物组合物，其中所述药剂用于治疗软骨发育不全。14.权利要求1-10中任意一项的控制释放CNP激动剂或权利要求11的药物组合物，其用在治疗能用CNP治疗的疾病的方法中。15.权利要求14的控制释放CNP激动剂或药物组合物，其中所述的能用CNP治疗的疾病选自：软骨发育不全、软骨发育不良、身材矮小症、侏儒症、骨软骨发育不良、致死性发育不良、成骨不全、软骨成长不全、点状软骨发育异常、纯合型软骨发育不全、屈肢骨发育不良、先天性致死型低磷酸酯酶症、围产期致死型成骨不全、短肋多指(趾)综合征、肢根型点状软骨发育异常、J...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·斯普罗格，H·拉乌，A·伯恩哈德，U·赫泽尔，F·克利曼，T·韦格，
申请(专利权)人：阿森迪斯药物生长障碍股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK