本发明专利技术提供了一种铜绿假单胞菌的扩增引物组、应用及铜绿假单胞菌的检测方法，所述检测铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：1)提取待检测铜绿假单胞菌样品的基因组；2)提供所述铜绿假单胞菌的特异基因oprL扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2、R2、C1*、C2*以及D1*、D2*；3)在包括所述扩增引物组的多交叉恒温扩增反应体系下，使用待检测铜绿假单胞菌样品的基因组核酸作为模板进行恒温扩增，得到扩增产物；4)使用金纳米生物传感器检测步骤3)的扩增产物。本发明专利技术所述方法以多交叉恒温扩增为基础，结合纳米生物检测技术，能够快捷，敏感，高特异性的鉴定铜绿假单胞菌。
【技术实现步骤摘要】
一种铜绿假单胞菌的扩增引物组、应用及铜绿假单胞菌的检测方法
本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种铜绿假单胞菌的扩增引物组、应用及铜绿假单胞菌的检测方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)又称绿脓杆菌，属假单胞菌属，是一种需氧的革兰阴性杆菌，也是一种常见的条件致病菌。该菌存在于土壤、尘埃、水和少数人体肠道中，亦可暂时寄生于皮肤，主要寄生在肛门、生殖器部位、腋窝和外耳道等处。典型的菌株产生蓝绿色绿脓菌青素和黄绿色绿脓黄素两种色素，在正常情况下铜绿假单胞菌一般不致病，当机体抵抗力低下时可致病，还可引起病人死亡。系统性铜绿假单胞菌感染可招致败血症，患者有发热、黄疸、脾大，并可发生肺炎、泌尿系感染、脑膜炎。皮肤铜绿假单胞菌感染常发生在持续潮湿的损害部位，尤其在婴儿的脐周、烧伤的表面，在浸渍的趾蹼、外耳道及耳郭亦常发生。该菌为专性需氧菌，生长温度范围25～42℃，最适生长温度为25～30℃，临床分离培养的初步鉴别可利用该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点进行鉴别。研究表明假单胞菌引起的医院感染有增多和加重的趋势，在医院感染标本中分离率已位居第一。其中以铜绿假单胞菌为主。目前临床上对于铜绿假单胞菌分离鉴定主要依赖于传统的细菌培养和生化鉴定，该方法包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，耗时至少3天，虽然生化鉴定的结果可以依靠全自动微生物鉴定仪判读，但该方法的劣势耗时耗力依然存在，严重地拖延临床的诊断及治疗时间。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于铜绿假单胞菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵复杂的仪器设备及高成本的探针合成，且需要后续的电泳步骤及熟练的操作人员。一些基层实验室无法满足上述条件，因此限制了这些技术在基层的应用。此外，目前运用PCR方法和real-timePCR方法检测铜绿假单胞菌的技术，检测过程也要耗时2-4小时，也不利于快速检测和应急检测。因此，为了给予临床病人准确快速的诊断，找出特异的抗菌治疗方法，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够快捷，敏感，特异的鉴定铜绿假单胞菌成为必要。
技术实现思路
针对现有技术中的上述缺陷，本专利技术的主要目的在于提供一种铜绿假单胞菌的扩增引物组、应用及铜绿假单胞菌的检测方法，所述方法以多交叉恒温扩增(MCDA)为基础，结合纳米生物检测技术，能够快捷，敏感，高特异性的鉴定铜绿假单胞菌。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种铜绿假单胞菌的扩增引物组，其特征在于：包括：如SEQIDNO：1所示的交叉内引物CP1，如SEQIDNO：2所示的交叉内引物CP2，如SEQIDNO：3所示的置换引物F1，如SEQIDNO：4所示的置换引物F2以及如SEQIDNO：5-10所示的扩增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2；所述扩增引物C1或C2的5’端标记生物素，得到C1*或C2*；所述扩增引物D1或D2的5’端标记半抗原，得到D1*或D2*。作为进一步的优选，所述半抗原为异硫氰酸荧光素(FITC)。作为进一步的优选，所述CP1包含C1区域的互补序列(Cls)和P1，为5′-Cls-P1；CP2包含C2区域的互补序列(C2s)和P2，为5′-C2s-P2。所述扩增引物组用于多交叉恒温扩增铜绿假单胞菌的oprL基因。一种检测铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：1)提取待检测铜绿假单胞菌样品的基因组；2)提供所述铜绿假单胞菌的扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2、R2、C1*、C2*以及D1*、D2*；3)在包括所述扩增引物组的多交叉恒温扩增反应体系下，使用待检测铜绿假单胞菌样品的基因组核酸作为模板进行恒温扩增，得到扩增产物；4)使用金纳米生物传感器检测步骤3)的扩增产物。作为进一步的优选，所述步骤3)恒温扩增可在60-69℃下进行。作为进一步的优选，所述引物C1和CP1的浓度为30pmol，引物CP2的浓度为60pmol，引物F1和F2的浓度为10pmol，引物R1，R2，D1*和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度为20pmol。作为进一步的优选，所述多交叉恒温扩增(MCDA)反应体系还包括10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×BstDNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。作为进一步的优选，所述MCDA反应体系的反应恒温在67℃下40min，85℃下5min终止反应。作为进一步的优选，所述金纳米生物传感器包含样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板；所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，所述纤维膜上设置有检测线及控制线；将金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-G)，抗异硫氰酸荧光素抗体(anti-FITC)及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)分别包被在金标垫，检测线及控制线上。本专利技术的有益效果是：本专利技术针对铜绿假单胞菌的特异基因oprL设计一套MCDA扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2和R2；为了构建可检测产物，在引物C1或C2的5’端标记生物素(Biotin)，在引物D1或D2的5’端标记半抗原，新标记的引物被命名为C1*或C2*以及D1*或D2*；上述两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物；置换引物F1和F2置换在MCDA反应中发挥置换作用，置换交叉引物CP1和CP2；六条扩增引物D1*，C1*，R1，D2*，C2*和R2能够加速MCDA反应及增加MCDA产物量。所述检测铜绿假单胞菌的方法针对铜绿假单胞菌特异基因oprL的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测，所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于推广至各种特异核苷酸片段，及应用于该特异核苷酸片段对应的病原菌的临床检测。附图说明图1为铜绿假单胞菌oprL基因的MCDA引物设计的位置和方向示意图。图2A为MCDA扩增原理示意图。图2B为金纳米生物传感器检测示意图。图3A-3C为MCDA引物验证结果图谱。图4A-4J为标准MCDA-LFB最佳反应温度测试结果图谱。图5A-5D为MCDA-LFB检测铜绿假单胞菌的灵敏度结果图谱。具体实施方式本专利技术通过提供一种铜绿假单胞菌的扩增引物组、应用及铜绿假单胞菌的检测方法，解决了现有技术检测铜绿假单胞菌的缺陷。为了解决上述缺陷，本专利技术实施例的主要思路是：本专利技术实施例铜绿假单胞菌的扩增引物组，其特征在于：包括：如SEQIDNO：1所示的交叉内引物CP1，如SEQIDNO：2所示的交叉内引物CP2，如SEQIDNO：3所示的置换引物F1，如SEQIDNO：4所示的置换引物F2以及如SEQIDNO：5-10所示的扩增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2；所述扩增引物C1或C2的5’端标记生物素，得到C1*或C2*；所述扩增引物D1或D2的5’端标记半抗原，得到D1*或D2*。本专利技术实施例检测铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：1)提取待检测铜绿假单胞菌样品的基因组；2)提供所述铜绿假单胞菌的扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2、R2、C1*、C2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种铜绿假单胞菌的扩增引物组，其特征在于：包括：如SEQ ID NO：1所示的交叉内引物CP1，如SEQ ID NO：2所示的交叉内引物CP2，如SEQ ID NO：3所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：4所示的置换引物F2以及如SEQ ID NO：5‑10所示的扩增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2；所述扩增引物C1或C2的5’端标记生物素，得到C1*或C2*；所述扩增引物D1或D2的5’端标记半抗原，得到D1*或D2*。
【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌的扩增引物组，其特征在于：包括：如SEQIDNO：1所示的交叉内引物CP1，如SEQIDNO：2所示的交叉内引物CP2，如SEQIDNO：3所示的置换引物F1，如SEQIDNO：4所示的置换引物F2以及如SEQIDNO：5-10所示的扩增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2；所述扩增引物C1或C2的5’端标记生物素，得到C1*或C2*；所述扩增引物D1或D2的5’端标记半抗原，得到D1*或D2*。2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌的扩增引物组，其特征在于：所述半抗原为异硫氰酸荧光素。3.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌的扩增引物组，其特征在于：所述交叉内引物CP1包含C1区域的互补序列Cls和P1，为5′-Cls-P1；所述交叉内引物CP2包含C2区域的互补序列C2s和P2，为5′-C2s-P2。4.如权利要求1-3任一项所述铜绿假单胞菌的扩增引物组的应用，其特征在于：所述扩增引物组用于多交叉恒温扩增铜绿假单胞菌的oprL基因。5.一种检测铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)提取待检测铜绿假单胞菌样品的基因组；2)提供所述铜绿假单胞菌的扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2、R2、C1*、C2*以及D1*、D2*；3)在包括所述扩增引物组的多交叉恒温扩增反应体系下，使用待检测铜绿假单胞菌样品的...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵帆，胡守奎，吴蕾，农金轻，高乃姝，朱晓雪，郑凤芝，王春梅，翟翼方，刘铭义，王静，蔡煜，袁平，
申请(专利权)人：北京大学首钢医院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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