基于微流控芯片检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒以及使用方法，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针。本发明专利技术的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对呼吸道合胞病毒A、B型进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道合胞病毒A、B型的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。

Detection kit for respiratory syncytial virus A and B based on microfluidic chip and its usage

The invention discloses a kit for detecting respiratory syncytial virus type A and B based on a microfluidic chip and a method for using the kit. The kit comprises a multi-flux microfluidic nucleic acid detection chip with an active control flow path, a pre-loaded dry powder detection reagent and a positive quality control substance; the pre-loaded dry powder detection reagent contains a respiratory syncytial virus. Primers and TaqMan fluorescent probes for A and B specific conserved sequences. The reagent kit of the invention adopts the microfluidic chip technology, after sampling, all operations are completed by the instrument, the operation is simple, the speed is fast, and the detection can be completed within 30-60 minutes without causing pollution; TaqMan probe fluorescent PCR technology is used to detect respiratory syncytial virus A and B, and the primer and probe sequence are designed. The genes listed in RSV A and B are very conservative, highly specific and can be detected within 2 hours with a sensitivity of 10 copies/mu L.

【技术实现步骤摘要】
基于微流控芯片检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus，RSV)是一种单链RNA病毒，属于副粘液病毒科，是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染最常见的原因之一。由于RSV在细胞中可以引起细胞融合病变，根据它在细胞培养中的细胞病变特征命名为呼吸道合胞病毒。RSV最显著的特征是每一次RSV感染只能调节以后感染的严重程度，产生的抗体并不能对机体产生永久性保护，因此RSV可反复感染。母传抗体也不能预防感染的发生，因而出生不久的小婴儿即可发病，常引起小儿间质性肺炎及毛细支气管炎，是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原体。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为毛细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为呼吸道感染。潜伏期3～7天，RSV感染有明显的季节性，主要暴发流行于冬春季节，每年的11月～次年2月为暴发流行的高峰季节。呼吸道合胞病毒是由包裹负链RNA的核衣壳和包膜组成的，其基因组编码10种蛋白质，包括7种结构蛋白(G、F、M1、M2、P、L、N)和3种非结构蛋白(NS1、NS2、SH)，其中G蛋白和F蛋白位于病毒颗粒的表面，是主要的糖蛋白。RSV根据抗原性的不同可分为A、B两亚型，两亚型间的主要区别在于G蛋白的基因差异，G蛋白是RSV毒株中变异最大的蛋白，仅存在5％的抗原相关性。有文献报道，A亚型呼吸道合胞病毒相较于B亚型，具有更强的致病性，婴幼儿感染后，B亚型比A亚型对同型G蛋白的抗原反应更强烈且有效。我国每隔数年会出现由呼吸道合胞病毒感染导致的流行性喘憋型肺炎，常造成数十万人发病，不同年份A、B亚型可以交替成为流行优势株。RSVA、RSVB亚型患儿均以咳嗽、喘息为主要症状，其次为鼻塞流涕、发热、呼吸困难，两亚型临床表现无明显差异。利用分子技术可以快速、准确地进行分型，避免误用或者滥用碱性药物，对呼吸道感染早期诊断以及正确治疗的意义十分重大。目前市场上针对呼吸道合胞病毒的检测方法主要有病毒培养法、免疫检测法和荧光PCR法。培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析。免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因。微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。目前市面上暂无利用荧光定量PCR法检测呼吸道合胞病毒A型、B型的同类试剂盒，但有这两种病原体单项或者包含这两种病原体的多项检测荧光定量PCR法试剂盒的专利技术专利，可以作为参照进行比对。其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量PCR仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种可同时快速检测呼吸道合胞病毒A、B型的基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，该基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；其中，特异性保守序列的引物序列为：呼吸道合胞病毒A型，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；呼吸道合胞病毒B型，SEQIDNO.4和SEQIDNO.5；特异性TaqMan探针序列为：呼吸道合胞病毒A型，SEQIDNO.3；呼吸道合胞病毒B型，SEQIDNO.6。上述技术方案的试剂盒可对呼吸道合胞病毒A、B型进行快速准确检测，能在各种环境中简便易用，保证检测的时效性、特异性和灵敏度；针对呼吸道合胞病毒A、B型各自的保守序列上设计特异性引物探针，并在探针上标记荧光信号，可以同时检测并区分出呼吸道合胞病毒A、B型；由于采用微流控芯片进行扩增，增大了反应腔内液体的比表面积，且热传导更快，能使试剂迅速的进行升降温，并能通过仪器和芯片配合控制反应液的密闭性，避免污染泄漏；试剂盒中检测试剂为干粉状态，预装在微流控芯片中，在不同的反应腔内分别预装有检测呼吸道合胞病毒A、B型的检测试剂干粉，可在4℃低温或常温下保存，使用时仅需加入提取好的核酸样本即可上机检测，解决了低温保存和使用操作繁琐的问题；本专利技术的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对呼吸道合胞病毒A、B型进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道合胞病毒A、B型的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。其中，SEQIDNO.1：CCATTCGCATCTCGCGTT；SEQIDNO.2：CATCGCACGTCAACAACG；SEQIDNO.3：GTAGGCTACATGTGGAAGAATGC；SEQIDNO.4：GTACACAAGGCTCCACAA；SEQIDNO.5：CGTATGATGTGTTGTAGCA；SEQIDNO.6：CTGTACAACTGTTCACACGTCTAGAA。优选的，所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStartTaq酶、逆转录酶和UNG酶。采用了UNG酶/dUTP防污染体系，能减少前次PCR反应产物带来的污染干扰；将逆转录酶与HotStartTaq酶混合使用，先进行逆转录过程合成出cDNA，再进行PCR扩增，没有添加随机引物，过程一步完成，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。所使用的探针为荧光标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核昔酸。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光PCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时HotStartTaq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；其中，特异性保守序列的引物序列为：呼吸道合胞病毒A型，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；呼吸道合胞病毒B型，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；特异性TaqMan探针序列为：呼吸道合胞病毒A型，SEQ ID NO.3；呼吸道合胞病毒B型，SEQ ID NO.6。

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针；其中，特异性保守序列的引物序列为：呼吸道合胞病毒A型，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；呼吸道合胞病毒B型，SEQIDNO.4和SEQIDNO.5；特异性TaqMan探针序列为：呼吸道合胞病毒A型，SEQIDNO.3；呼吸道合胞病毒B型，SEQIDNO.6。2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒，其特征在于，所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStartTaq酶、逆转录酶和UNG酶。3.根据权利要求2所述的基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述HotStartTaq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.1mM～2mM；所述MgCl2在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。4.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有呼吸道合胞病毒A、B型的扩增基因序列的质粒。5.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检...

【专利技术属性】
技术研发人员：许行尚，杰弗瑞·陈，王龙，于沛，张蓉蓉，
申请(专利权)人：南京岚煜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32