一种草鱼出血病毒的检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于草鱼出血病毒VP5基因序列扩增的引物对。本发明专利技术还公开了一种草鱼出血病毒VP5基因序列的扩增方法。本发明专利技术还公开了一种草鱼出血病毒的检测试剂盒以及检测方法。本发明专利技术建立的一步法荧光定量RT‑PCR方法与已报道的方法相比，不仅简单、快速，而且准确、灵敏、检出限低。该方法能快速、准确测定患病鱼体组织中的病毒及含量。

A detection kit for grass carp hemorrhagic virus and its detection method

The invention discloses a primer pair used for sequence amplification of grass carp hemorrhagic virus VP5 gene. The invention also discloses a method for amplifying the sequence of grass carp hemorrhagic virus VP5 gene. The invention also discloses a detection kit for grass carp hemorrhagic virus and a detection method thereof. Compared with the reported method, the one-step fluorescence quantitative RT_PCR method is not only simple and rapid, but also accurate, sensitive and has low detection limit. This method can quickly and accurately detect virus and content in sick fish tissues.

【技术实现步骤摘要】
一种草鱼出血病毒的检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及鱼类致病病毒的检测领域，涉及一种鱼类致病病毒检测试剂盒以及检测方法，尤其涉及一种草鱼出血病毒的检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
草鱼出血病毒(grasscarphemorrhagevirus,GCHV，国际病毒分类委员会称之为reovirusofgrasscarp,GCRV)是中国分离的第一种鱼类病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70～80nm，20面体球形颗粒，含有11个片段的双链RNA。不同地区存在不同的毒株。目前已报道了10个分离株，该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90％以上，给水产养殖业造成巨大损失。草鱼病毒性出血常发生在每年4－10月，当水温在15℃以下病情逐渐消失。其主要症状是充血，病鱼口腔、鳃盖、鳍基、肠道、肝、脾等器官出血现象，严重时全身肌肉呈鲜红色，鳃失去鲜红呈苍白色，但肠道、肌肉无腐烂、水肿现象出现。为了及时控制养殖鱼类鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼体内是否存在该致病病毒的技术。荧光定量聚合酶链反应(Real-timeFluorescentQuantitativePolymeraseChainReaction,RtFQ-PCR)因其具有简便、快速、敏感、特异、适于早期和大量样品检测的优点，已在病原检测领域得到了广泛应用。目前对于草鱼出血病毒的检测国内尚没有相关的定量PCR检测技术方面的研究报告。草鱼出血病毒是一种RNA病毒，普通的检测过程复杂，RNA易降解，导致假阴性出现。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的所要解决的技术问题是提供用于荧光定量基因扩增法快速检测GCHV-strain873毒株的VP5基因序列(AF239175.1)引物及其应用，从分子水平对草鱼出血病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种草鱼出血病毒荧光定量一步法检测试剂盒，根据Genbank公布的GCHV-strain873毒株的VP5基因序列(AF239175.1)，设计特异性引物，利用荧光定量RT-PCR扩增靶基因的特定区域，从分子水平上对草鱼出血病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种一步法荧光定量检测试剂盒检测草鱼出血病毒的方法，能检测GCHV感染的病鱼组织和细胞等。技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本专利技术采用以下技术方案：一种用于草鱼出血病毒VP5基因序列扩增的引物对，所述引物对包括上游引物VP5-Ⅱ-F和下游引物VP5-Ⅱ-R，所述上游引物VP5-Ⅱ-F的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述下游引物VP5-Ⅱ-R的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。上游引物VP5-Ⅱ-F：5’-CTCCGTGTTGACCCTGGATGTG-3'；下游引物VP5-Ⅱ-R：5’-ATGTTAGCAGCGGTAGTGACTTGTTG-3'。一种草鱼出血病毒VP5基因序列的扩增方法，包括以下步骤：1)生物信息学方法设计引物组及进行引物筛选得到所述的引物对；2)草鱼出血病毒VP5基因的荧光定量PCR检测：用病毒RNA提取试剂盒提取获得草鱼出血病毒基因组RNA样本；3)以步骤2)的草鱼出血病毒基因组RNA样本为模板，将所述的引物对进行一步法荧光定量RT-PCR获得PCR扩增产物；4)步骤3)得到的PCR扩增产物分析并测序获得草鱼出血病毒VP5基因序列。其中，上述步骤1)是通过荧光定量PCR进行引物PCR扩增效率检测从而筛选得到所述的引物对。一种草鱼出血病毒的检测试剂盒，所述草鱼出血病毒的检测试剂盒包括所述的引物对。其中，上述上游引物VP5-Ⅱ-F和下游引物VP5-Ⅱ-R的摩尔浓度比是1.5：1。其中，上述检测试剂盒包括：1)草鱼出血病毒反应液、TaqDNA聚合酶和反转录酶(QuantReverseTranscriptase)：草鱼出血病毒反应液包括含有dNTPs、10×buffer、MgC12、SYBRgreenI、DEPC水及所述的引物对的混合液；2)阳性对照物：3)临界阳性对照物；4)阴性对照物。其中，上述阳性对照物是含有高纯度草鱼出血病毒提取的总RNA。上述的草鱼出血病毒的检测试剂盒在鱼类致病菌的检测方面的应用。其中，上述检测方法是将RNA反转录和荧光定量PCR反应在同一个反应管内连续进行。其中，上述检测方法具体包括以下步骤：1)提取鱼样组织的RNA得到样品RNA；2)建立一步法荧光定量RT-PCR反应体系；3)通过比对标准品实时荧光定量RT-PCR扩增曲线确定是否感染草鱼出血病毒。所述检测方法是一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法，其反应体系是：10pmol/μL的上游引物3.0μL，10pmol/μL的下游引物2.0μL，样品RNA5μL，2.5U/μLTaqDNA聚合酶2.5μL，5U/μL反转录酶(QuantReverseTranscriptase)0.5μL，12μLDEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液25μL；所述25μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是5μL的ThermoFisher公司的10×buffer、4μL的10mMdNTP、0.005μL的10000×SYBRgreenI以及16μLDEPC水的混合物；PCR反应条件为：50℃30min；95℃3min；95℃10sec，60℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，readplate共45个循环。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点是：1、本专利技术首次提供了草鱼出血病毒VP5基因荧光定量RT-PCR检测中的专用引物，使利用荧光定量RT-PCR检测草鱼出血病毒VP5基因成为可能。2、本专利技术的草鱼出血病毒的检测试剂盒还包括阳性对照物；所述阳性对照物是含有高纯度草鱼出血病毒的RNA提取物。不含活病毒，最大限度的保障了本试剂盒的生物安全性。3、本专利技术检测方法与草鱼出血病毒其他常规检测方法，如病毒的分离培养鉴定、酶联免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，灵敏度和特异性极高，检测效率得到了很大的提高。4、本专利技术检测方法采用一步法荧光定量RT-PCR检测，即将RNA反转录和荧光定量PCR反应在同一个反应管内连续进行。减少了反转录的步骤，与普通的荧光定量检测方法相比，具有操作程序简单易用，并能有效防止污染的特点。本反应体系由于可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适用于微量RNA的检测。5、本专利技术检测方法与草鱼出血病毒的其他检测方法，如病毒的分离培养鉴定、酶联免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，本试剂盒可用于操作程序化，适合大面积推广和应用。综上所述，本专利技术能为快速、准确地检测出草鱼出血病毒提供保证，为预防疾病，科学用药，和保障鱼类健康提供了保障。依据本专利技术专用引物的检测方法及试剂盒可用于鱼主要患病组织(鳃、肠道、肝、脾)VP5基因的核酸检测。附图说明图1是采用三对引物分别对于草鱼出血病毒的目标靶基因进行扩增后的电泳图；图中DNAmarker大小从上到下依次是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；图2是采用三对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于草鱼出血病毒VP5基因序列扩增的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物VP5‑Ⅱ‑F和下游引物VP5‑Ⅱ‑R，所述上游引物VP5‑Ⅱ‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述下游引物VP5‑Ⅱ‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于草鱼出血病毒VP5基因序列扩增的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物VP5-Ⅱ-F和下游引物VP5-Ⅱ-R，所述上游引物VP5-Ⅱ-F的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述下游引物VP5-Ⅱ-R的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。2.一种草鱼出血病毒VP5基因序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：1）生物信息学方法设计引物组及进行引物筛选得到如权利要求1所述的引物对；2）草鱼出血病毒VP5基因的荧光定量PCR检测：用病毒RNA提取试剂盒提取草鱼出血病毒基因组RNA；3）以步骤2）的草鱼出血病毒基因组RNA样本为模板，将权利要求1所述的引物对进行一步法荧光定量RT-PCR获得PCR扩增产物；4）步骤3）得到的PCR扩增产物分析并测序获得草鱼出血病毒VP5基因序列。3.根据权利要求2所述的一种草鱼出血病毒VP5基因序列的扩增方法，其特征在于，所述步骤1）是通过荧光定量RT-PCR进行引物PCR扩增效率检测从而筛选得到权利要求1所述的引物对。4.一种草鱼出血病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述草鱼出血病毒的检测试剂盒包括权利要求1所述的引物对。5.根据权利要求4所述的草鱼出血...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金，朱馨蕾，
申请(专利权)人：转导精进武汉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42