一种致泻病原微生物的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种致泻病原微生物的检测试剂盒，涉及微生物检测领域。该试剂盒如下引物对中的一种或多种的组合：SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4、SEQ ID NO.5‑6、SEQ ID NO.7‑8、SEQ ID NO.9‑10、SEQ ID NO.11‑12、SEQ ID NO.13‑14、SEQ ID NO.15‑16、SEQ ID NO.17‑18、SEQ ID NO.19‑20、SEQ ID NO.23‑24、SEQ ID NO.25‑26、SEQ ID NO.27‑28、SEQ ID NO.29‑30以及SEQ ID NO.31‑32；具有特异性和灵敏度高等特点。

A kit for detecting pathogenic microorganisms in diarrhoea

The invention discloses a detection kit for diarrhoea pathogenic microorganism, and relates to the field of microbial detection. One or more combinations of primer pairs in the kit are SEQ ID NO.1_2, SEQ ID NO.3_4, SEQ ID NO.5_6, SEQ ID NO.7_8, SEQ ID NO.9_10, SEQ ID NO.11_12, SEQ ID NO.13_14, SEQ ID NO.15_16, SEQ ID NO.17_18, SEQ ID 20, SEQ NO.23_24, SEQ I D NO.25_26, SEQ ID NO.27_28, SEQ ID NO.29_30 and SEQ ID NO.31_32; with high specificity and sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种致泻病原微生物的检测试剂盒
本专利技术涉及病原微生物检测
，具体而言，涉及一种致泻病原微生物的检测试剂盒。
技术介绍
腹泻是一种发病率高并流行于世界各地的胃肠道传染病，其发病率仅次于上呼吸道感，病原菌造成的腹泻是我国的常见病和多发病，病因比较复杂，尤其对婴幼儿人群危害更大，因此亟需建立腹泻病原菌的快速高效的诊断方法。常见的腹泻病原菌有以下几种。霍乱是由O1霍乱弧菌Vibriocholerae或O139霍乱弧菌Vibriocholerae引起的一种肠道传染病，是发展中国家的一个主要公共卫生问题。每年估计有300万-500万霍乱病例。沙门氏菌Salmonellaenterica是引起全球性食源性感染最严重的致病菌之一(FAO/WHO2009)，可引起恶心、呕吐、腹泻等，严重时可导致感染者产生败血症，甚至死亡。自1982年首次在美国发现后，先后在英国、加拿大、德国等世界范围内相继爆发。在欧洲，超过2500个沙门氏菌血清型中，肠炎沙门氏菌占主要地位，引起超过60％的感染病例。在中国，70％～80％细菌性食物中毒都由沙门氏菌引起。副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus是一种广泛分布于近岸海水、海底沉积物和海产品中的嗜盐性细菌，也是引起我国特别是沿海地区细菌性食物中毒危害的首要食源性致病菌。痢疾菌Shigella是最常见的肠杆菌科的病原菌，可引起人类肠道传染病。空肠弯曲杆菌Campylobacterjejuni是弯曲菌属胎儿弯曲菌种的亚种之一。其引起人类肠炎和腹泻的事件在世界各地都有报导，并作为“人类一种新的疾病”被引起注意。在发达国家，空肠弯曲菌是次于轮状病毒引起儿童结肠炎的病原。腺病毒40/41型(Adenovirus)、星状病毒(Astrovirus)、诺如病毒GI型(NovirusGI)、诺如病毒GII型(NovirusGII)、轮状病毒(RotavirusA)、札如病毒(Sapovirus)，均能引起腹泻。在我国及发达国家由细菌和病毒引起的食品中毒事件均占较大比例。现阶段这些造成腹泻的病原微生物的检测基本都是采用分子生物学的方法进行，例如荧光定量PCR方法、基因芯片技术等。荧光定量PCR方法是主流检测方法，但该方法存在检测通量低，操作要求高等缺点。同时基于核酸水平的基因芯片技术也被广泛应用于致病性细菌的检测，但是基因芯片技术目前绝大多数还处于实验室阶段，更多的用于基础性研究而不能平民化应用。且目前基因芯片法一般采用玻璃片作为固相支持物，实验过程需要相应的点样仪和芯片识读仪，成本较高。因此研发一种快速、方便、灵敏度高、价格低廉、可视化和高通量的检测方法将具有非常好的应用前景及市场推广能力。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测致泻病原微生物的核酸组合，该核酸组合可以检测出样本中致泻病原微生物(例如沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型)，具有特异性好、灵敏度高等特点，其可以用于普通PCR技术、RT-PCR技术、膜芯片杂交技术等平台，具有广阔的应用前景。本专利技术的另一目的在于提供一种致泻病原微生物的检测试剂盒，该检测试剂盒含有上述的核酸组合，该检测试剂盒可直接用于检测出样本的致泻病原微生物(例如沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型)，具有特异性好、灵敏度高、使用方便等特点。本专利技术的再一目的在于提供一种检测致泻病原微生物的方法，该检测方法使用上述的核酸组合对样本中的致泻病原微生物(例如沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型)进行检测，具有特异性好、灵敏度高、操作方便、结果准确、易于观察等特点。本专利技术是这样实现的：一方面，本专利技术提供的一种检测致泻病原微生物的核酸组合，其包括：其包括如下引物对中的一种或多种的组合：用于检测沙门氏菌invA基因且包括SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物的第一引物对；用于检测沙门氏菌ttr基因且包括SEQIDNO.3所示的上游引物和SEQIDNO.4所示的下游引物的第二引物对；用于检测痢疾菌ipaH基因且包括SEQIDNO.5所示的上游引物和SEQIDNO.6所示的下游引物的第三引物对；用于检测霍乱弧菌ompW基因且包括SEQIDNO.7所示的上游引物和SEQIDNO.8所示的下游引物的第四引物对；用于检测霍乱弧菌ctxAB基因且包括SEQIDNO.9所示的上游引物和SEQIDNO.10所示的下游引物的第五引物对；用于检测副溶血性弧菌toxR基因且包括SEQIDNO.11所示的上游引物和SEQIDNO.12所示的下游引物的第六引物对；用于检测副溶血性弧菌tdh基因且包括SEQIDNO.13所示的上游引物和SEQIDNO.14所示的下游引物的第七引物对；用于检测副溶血性弧菌trh基因且包括SEQIDNO.15所示的上游引物和SEQIDNO.16所示的下游引物的第八引物对；用于检测空肠弯曲菌hipO基因且包括SEQIDNO.17所示的上游引物和SEQIDNO.18所示的下游引物的第九引物对；用于检测腺病毒且包括SEQIDNO.19所示的上游引物和SEQIDNO.20所示的下游引物的第十引物对；用于检测札如病毒且包括SEQIDNO.23所示的上游引物和SEQIDNO.24所示的下游引物的第十一引物对；用于检测星状病毒且包括SEQIDNO.25所示的上游引物和SEQIDNO.26所示的下游引物的第十二引物对；用于检测轮状病毒且包括SEQIDNO.27所示的上游引物和SEQIDNO.28所示的下游引物的第十三引物对；用于检测诺如病毒GI型且包括SEQIDNO.29所示的上游引物和SEQIDNO.30所示的下游引物的第十四引物对；以及，用于检测诺如病毒GII型且包括SEQIDNO.31所示的上游引物和SEQIDNO.32所示的下游引物的第十五引物对。在都以DNA为模板的前提下，上述15种引物对可同时在同一体系中进行多重PCR，避免非特异性扩增，具有较高的特异性和灵敏度。此外，在多重PCR的基础上使用上述的核酸组合还可同时进行非对称PCR扩增(AsymmetricPCR)，用以提高检测灵敏度。非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的上游引物和下游引物(或是扩增延伸条件不同的上游引物和下游引物)，PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的对应的探针杂交，从而提高检测灵敏度。当然，在实际的检测过程中，由于札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型和诺如病毒GII型等，其遗传物质为RNA，需要将其反转成DNA后才能进行PCR。基于此，可将第一引物对至第十引物对对来自样本的总核酸(含DNA和RNA)模板进行多重普通PCR扩增，然后用第十一引物对至第十五引物对对来自样本的总核酸(含DNA和RNA)模板采用一步法进行多重RT-PCR扩增，然后将两次扩增的产物混合(也可以不混合，单独进行)后与相应的探针杂交检测出相应的致本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种致泻病原微生物的检测试剂盒，其特征在于，其包括核酸组合，所述核酸组合包括如下引物对中的一种或多种的组合：用于检测沙门氏菌invA基因且包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物的第一引物对；用于检测沙门氏菌ttr基因且包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物的第二引物对；用于检测痢疾菌ipaH基因且包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物的第三引物对；用于检测霍乱弧菌ompW基因且包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物的第四引物对；用于检测霍乱弧菌ctxAB基因且包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物的第五引物对；用于检测副溶血性弧菌toxR基因且包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物的第六引物对；用于检测副溶血性弧菌tdh基因且包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物的第七引物对；用于检测副溶血性弧菌trh基因且包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物的第八引物对；用于检测空肠弯曲菌hipO基因且包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物的第九引物对；用于检测腺病毒且包括SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物的第十引物对；用于检测札如病毒且包括SEQ ID NO.23所示的上游引物和SEQ ID NO.24所示的下游引物的第十一引物对；用于检测星状病毒且包括SEQ ID NO.25所示的上游引物和SEQ ID NO.26所示的下游引物的第十二引物对；用于检测轮状病毒且包括SEQ ID NO.27所示的上游引物和SEQ ID NO.28所示的下游引物的第十三引物对；用于检测诺如病毒GI型且包括SEQ ID NO.29所示的上游引物和SEQ ID NO.30所示的下游引物的第十四引物对；以及，用于检测诺如病毒GII型且包括SEQ ID NO.31所示的上游引物和SEQ ID NO.32所示的下游引物的第十五引物对。...

【技术特征摘要】
1.一种致泻病原微生物的检测试剂盒，其特征在于，其包括核酸组合，所述核酸组合包括如下引物对中的一种或多种的组合：用于检测沙门氏菌invA基因且包括SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物的第一引物对；用于检测沙门氏菌ttr基因且包括SEQIDNO.3所示的上游引物和SEQIDNO.4所示的下游引物的第二引物对；用于检测痢疾菌ipaH基因且包括SEQIDNO.5所示的上游引物和SEQIDNO.6所示的下游引物的第三引物对；用于检测霍乱弧菌ompW基因且包括SEQIDNO.7所示的上游引物和SEQIDNO.8所示的下游引物的第四引物对；用于检测霍乱弧菌ctxAB基因且包括SEQIDNO.9所示的上游引物和SEQIDNO.10所示的下游引物的第五引物对；用于检测副溶血性弧菌toxR基因且包括SEQIDNO.11所示的上游引物和SEQIDNO.12所示的下游引物的第六引物对；用于检测副溶血性弧菌tdh基因且包括SEQIDNO.13所示的上游引物和SEQIDNO.14所示的下游引物的第七引物对；用于检测副溶血性弧菌trh基因且包括SEQIDNO.15所示的上游引物和SEQIDNO.16所示的下游引物的第八引物对；用于检测空肠弯曲菌hipO基因且包括SEQIDNO.17所示的上游引物和SEQIDNO.18所示的下游引物的第九引物对；用于检测腺病毒且包括SEQIDNO.19所示的上游引物和SEQIDNO.20所示的下游引物的第十引物对；用于检测札如病毒且包括SEQIDNO.23所示的上游引物和SEQIDNO.24所示的下游引物的第十一引物对；用于检测星状病毒且包括SEQIDNO.25所示的上游引物和SEQIDNO.26所示的下游引物的第十二引物对；用于检测轮状病毒且包括SEQIDNO.27所示的上游引物和SEQIDNO.28所示的下游引物的第十三引物对；用于检测诺如病毒GI型且包括SEQIDNO.29所示的上游引物和SEQIDNO.30所示的下游引物的第十四引物对；以及，用于检测诺如病毒GII型且包括SEQIDNO.31所示的上游引物和SEQIDNO.32所示的下游引物的第十五引物对。2.根据权利要求1所述的致泻病原微生物的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括膜芯片，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQIDNO.35-49所示的探针中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的致泻病原微生物的检测试剂盒，其特征在于，所述膜芯片上还固定有如下探针中的一种或几种：内参探针、外参探针、阳性对照探针以及阴性对照探针；所述内参探针碱基序列如SEQIDNO.50所示，所述外参探针的碱基序列如SEQIDNO.51所示，所述阳性对照探针的碱基序列如SEQIDNO.52所示，所述阴性对照探针的碱基序列如SEQIDNO.53所示。4.根据权利要求3所述的致泻病原微生物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周航，张红光，彭丽，黄莉，
申请(专利权)人：四川华汉三创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51