一种检测鲤春病毒血症病毒的LAMP引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供的一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP引物组、检测试剂盒及其检测方法，可以通过实时荧光和LAMP方法的结合，具有操作简便、特异性强、灵敏度高、稳定性强、鉴别简单的特点。依托于LAMP技术，本发明专利技术的反应时间短，为快速检测提供了技术支持，因此本发明专利技术满足检测要求，在病原体检测中有极高的应用价值。

LAMP primer set, reagent kit and method for detecting virus of carp spring viremia

The invention provides a real-time fluorescent LAMP primer group, a detection kit and a detection method for carp vernaviremia virus. The method can be combined with real-time fluorescence and LAMP method, and has the characteristics of simple operation, strong specificity, high sensitivity, strong stability and simple identification. Relying on LAMP technology, the invention has short reaction time and provides technical support for rapid detection. Therefore, the invention meets the detection requirements and has high application value in pathogen detection.

【技术实现步骤摘要】
一种检测鲤春病毒血症病毒的LAMP引物组、试剂盒及方法
本专利技术属于水生动物病原体检测领域，关于一种鲤春病毒血症病毒(SVCV)的实时荧光LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
鲤春病毒血症(Springviremiaofcarp,SVC，又称鲤鱼传染性腹水症)是由鲤弹状病毒引起的一种鲤鱼科急性、出血性的传染性疾病。以全身出血及腹水、发病急、死亡率高为特征。世界动物卫生组织将其列为需要申报的疫病之一。传染源主要为病鱼、死鱼和带毒鱼，传播的途径为经水传播，病毒可经鳃和肠道入侵；也可能垂直传播，或由某些水生吸血寄生虫(例如鲺、尺蠖、鱼蛭等)机械传播。SVC主要感染1岁以上的鲤鱼、鲢、鳙、欧鲫和六须鲶等，还可使虹鳟、草鱼、狗鱼人工感染。病鱼和带毒鱼主要经粪排毒，其尿液、精液和鱼卵中也含有病毒。本病在欧、亚两洲均有流行，是鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。因此，制备一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测试剂盒为目前所需。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP引物。本专利技术的另一目的在于提供一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测的引物组，引物组的核苷酸序列如下所示：鲤春病毒血症病毒外引物：SVCV-F3：5'-GCAACCTGTAATTCAGCCA-3'，SVCV-B3：5'-ACTGTTGTGACAGATGCC-3'；鲤春病毒血症病毒内引物：SVCV-FIP：5'-GCATGGCAGATCCATCCAGAAGGATTGAGTGCCACCAA-3'，SVCV-BIP：5'-TTGTGATTACAGATGGTACGGACCGTTCCTGATGCAATCCTTGA-3'；鲤春病毒血症病毒环引物：SVCV-LF：5'-CTGTACTGAAGACAGATGGAGATT-3'，SVCV-LB：5'-GTATTCATCCAATCAGTCCTACCA-3'。一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物组。一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测方法，包含以下步骤：1)提取样本RNA；2)以提取的RNA作为模板，使用上述所述的引物SVCV-F3、SVCV-B3、SVCV-FIP、SVCV-BIP、SVCV-LF和SVCV-LB进行实时荧光LAMP扩增反应获得产物；3)根据扩增曲线进行分析，确定样品中是否含有鲤春病毒血症病毒；上述方法不用于疾病的诊断和治疗。进一步的，实时荧光LAMP扩增反应体系为：进一步的，所述的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。进一步的，所述的逆转录酶为AMV逆转录酶。进一步的，所述的封闭液为甘油。进一步的，步骤2)的实时荧光LAMP反应程序为：63℃反应30s；63℃反应15s，63℃反应45s，循环60次；并在63℃反应45s时收集FAM荧光通道的信号。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测试剂盒及其检测方法，可以通过实时荧光和LAMP方法的结合，具有操作简便、特异性强、灵敏度高、稳定性强、鉴别简单的特点。依托于LAMP技术，本专利技术的反应时间相比于Taqman法缩短30min以上，为快速检测提供了技术支持，因此本专利技术满足检测要求，有利于在病原体检测中推广应用。附图说明图1是鲤春病毒血症病毒实时荧光LAMP的扩增曲线图；图2是本专利技术方法对10个样品的扩增检测曲线图；图3是本专利技术方法的灵敏度检测扩增曲线图；图4是本专利技术方法的特异性检测扩增曲线图；图5是本专利技术方法的稳定性检测扩增曲线图一；图6是本专利技术方法的稳定性检测扩增曲线图二。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测引物本专利技术根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)的实时荧光LAMP的核酸序列，设计了大量用于检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的实时荧光LAMP的引物和探针；本专利技术经过大量筛选，筛选出一组灵敏度高和特异性强的引物，序列如下：鲤春病毒血症病毒外引物：SVCV-F3：5'-GCAACCTGTAATTCAGCCA-3'(SEQIDNO:1)，SVCV-B3：5'-ACTGTTGTGACAGATGCC-3'(SEQIDNO:2)；鲤春病毒血症病毒内引物：SVCV-FIP：5'-GCATGGCAGATCCATCCAGAAGGATTGAGTGCCACCAA-3'(SEQIDNO:3)，SVCV-BIP：5'-TTGTGATTACAGATGGTACGGACCGTTCCTGATGCAATCCTTGA-3'(SEQIDNO:4)；鲤春病毒血症病毒环引物：SVCV-LF：5'-CTGTACTGAAGACAGATGGAGATT-3'(SEQIDNO:5)，SVCV-LB：5'-GTATTCATCCAATCAGTCCTACCA-3'(SEQIDNO:6)。实施例2阳性标准品制备、实时荧光LAMP检测方法1)标准样品的制备阳性标准品：由上海旭冠生物科技发展有限公司对鲤春病毒血症病毒的目的基因进行全基因合成。阴性对照：ddH2O。2)阳性标准样品的实时荧光LAMP在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行扩增，同时设立阴性对照组；其中，实时荧光LAMP扩增反应体系为：所述的封闭液为甘油。实时荧光LAMP扩增反应程序为：63℃反应30s；63℃反应15s，63℃反应45s，循环60次；并在63℃反应45s时收集FAM荧光通道的信号。3)绘制标准曲线及结果分析检测结果如图1所示，图1为鲤春病毒血症病毒阳性标准品和阴性对照的扩增曲线图。从图中可以看出，阳性对照出现扩增曲线，但阴性对照荧光值没有显著变化。上述结果说明本专利技术针对鲤春病毒血症病毒设计特异性引物，在反应体系中含有鲤春病毒血症病毒的模板的情况下，可以实现实时荧光LAMP反应，并释放荧光信号。利用扩增仪器对反应过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。实施例3一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测方法1)样本核酸提取：提取10例样品的核酸。2)以提取的核酸为模板进行实时荧光LAMP检测，反应体系为：所述的封闭液为甘油。实时荧光LAMP扩增反应程序为：63℃反应30s；63℃反应15s，63℃反应45s，循环60次；并在63℃反应45s时收集FAM荧光通道的信号。同时，设置阴性对照组和阳性对照组，其中阴性对照为不含有鲤春病毒血症病毒的生理盐水溶液。阳性对照组为含有鲤春病毒血症病毒阳性标准品的溶液。3)结果分析：通过荧光扩增曲线图来判断结果的阴阳性，确定样品中是否含有鲤春病毒血症病毒。当扩增曲线图Ct值≤36并呈现明显增长时，结果判定为阳性；当扩增曲线图Ct值>36时，需进行第二次检测，第二次检测仍出现扩增曲线的，结果判定为阳性，未出来扩增曲线的，结果判定为阴性。检测结果如图2所示，图中为阴性对照组和样本的扩增结果，其中10份样品均未出现扩增曲线，均不含有鲤春病毒血症病毒。检测结果符合预期，准确率达100％。实施例4鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP灵敏度检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测的引物组，其特征在于，引物组的核苷酸序列如下所示：鲤春病毒血症病毒外引物：SVCV‑F3：5'‑GCAACCTGTAATTCAGCCA‑3'，SVCV‑B3：5'‑ACTGTTGTGACAGATGCC‑3'；鲤春病毒血症病毒内引物：SVCV‑FIP：5'‑GCATGGCAGATCCATCCAGAAGGATTGAGTGCCACCAA‑3'，SVCV‑BIP：5'‑TTGTGATTACAGATGGTACGGACCGTTCCTGATGCAATCCTTGA‑3'；鲤春病毒血症病毒环引物：SVCV‑LF：5'‑CTGTACTGAAGACAGATGGAGATT‑3'，SVCV‑LB：5'‑GTATTCATCCAATCAGTCCTACCA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测的引物组，其特征在于，引物组的核苷酸序列如下所示：鲤春病毒血症病毒外引物：SVCV-F3：5'-GCAACCTGTAATTCAGCCA-3'，SVCV-B3：5'-ACTGTTGTGACAGATGCC-3'；鲤春病毒血症病毒内引物：SVCV-FIP：5'-GCATGGCAGATCCATCCAGAAGGATTGAGTGCCACCAA-3'，SVCV-BIP：5'-TTGTGATTACAGATGGTACGGACCGTTCCTGATGCAATCCTTGA-3'；鲤春病毒血症病毒环引物：SVCV-LF：5'-CTGTACTGAAGACAGATGGAGATT-3'，SVCV-LB：5'-GTATTCATCCAATCAGTCCTACCA-3'。2.一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光LAMP检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1所述的引物组。3.一种鲤春病毒血症病毒的实时荧光L...

【专利技术属性】
技术研发人员：薄清如，邵建宏，赵福振，冯家望，王小玉，沙才华，廖秀云，罗宝正，
申请(专利权)人：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44