肠道病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种肠道病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法；该方法针对肠道病毒中A组、B组和C组所有血清型的VP1基因，以及柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒71型的VP1基因保守区域设计三组引物探针SEQ ID No.1～SEQ ID No.9所示，三条探针选择不同的荧光标记，实现了一管反应体系中同时对肠道病毒及两种血清型的肠道病毒进行鉴定，简化了肠道病毒流行血清型实验室检测流程。同时公开了待检样本的处理、荧光RT‑PCR反应体系及反应条件。本发明专利技术可以实现对我国大陆流行的肠道病毒及常见两种血清型的检测，操作简单、应用方便，为肠道病毒感染病原学和临床流行病学研究提供了可行的技术方法。

Primers and identification methods for identification of enteroviruses

The present invention discloses a primer probe and identification method for typing and identification of enteroviruses. The method designs three groups of primer probes SEQ ID No.1-SEQ ID No.9 for VP1 gene of all serotypes of group A, group B and group C in enteroviruses, and conserved regions of VP1 gene of group A, 16 and 71 of coxsackieviruses. Different fluorescent markers were used to identify enteroviruses and two serotypes simultaneously in one tube reaction system, which simplified the laboratory detection process of enterovirus epidemic serotypes. At the same time, the processing of the samples to be inspected, the reaction system of RT PCR and reaction conditions were also disclosed. The invention can realize the detection of enteroviruses and two common serotypes prevalent in the mainland of China, has simple operation and convenient application, and provides a feasible technical method for the research of enterovirus infection etiology and clinical epidemiology.

【技术实现步骤摘要】
肠道病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种肠道病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法。
技术介绍
通常情况下，肠道病毒引起的症状都比较温和，但是也会引起脑炎、心肌炎、脊髓灰质炎、急性心力衰竭和脓毒症这类严重病症。疾病活动呈现季节性流行趋势，在温带地区夏季和初秋为流行高峰。肠道病毒属于小RNA病毒家族，根据感染实验动物在组织培养和疾病形式的不同最初可以划分为四个血清型组，包括脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A组，柯萨奇病毒B组，艾可病毒。根据遗传及表型的相似性肠道病毒又进一步划分为多个血清型，截至目前有超过110个血清型。肠道病毒在基因组复制过程易产生错误，随着时间的累积而发生突变。肠道病毒之间的重配现象非常普遍，重配又进一步增加的遗传的多样性，同时也为临床诊断带来了困难。由于Real-timeRT-PCR(rRT-PCR)的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。通过rRT-PCR方法对肠道病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内对疑似感染样本进行确诊，该方法应用于临床标本检测时，可用于肠道病原监测以及临床流行病学研究。应用rRT-PCR方法对病毒核酸进行检测时，其难点之一在于在病毒的变异为引物和探针设计带来困难，为了准确对流行中的肠道病毒进行鉴定，需要定期对流行毒株的序列进行比对和分析，如分型鉴定引物探针不再适用于流行的毒株，则需要对引物和探针序列进行更新。其二在于使用相同荧光标记的血清型鉴定探针，同一检测反应体系中只能对一种血清型的肠道病毒进行分型鉴定，如果需要对多个血清型进行分型鉴定，则需要更多的标本量，反应体系的配置和鉴定结果报告时间相应的增加。其三在于使用不同荧光标记探针的检测体系，特别是三重及以上荧光标记的体系，对引物探针的设计及反应体系的优化都提出了更高的要求。本专利技术选择在相对保守区域设计引物探针，选用特异性高的引物和Taqman探针，同时选用三种不同的荧光标记探针，优化了反应体系中引物和探针的浓度，避免了多重荧光反应体系中不同引物之间干扰，实现单次检测即对疑似肠道病毒感染样本进行鉴定，并能够对我国主要流行的两种血清型的病毒进行分型鉴定，进一步简化操作，节省检测时间，
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提出一种操作简单、应用方便、鉴定分型精确的肠道病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术涉及一种rRT-PCR引物和探针组合，包括长度为19～29bp的用于扩增肠道病毒以及CA16和EV71血清型肠道病毒的基因。优选的，所述组合包括针对肠道病毒中A组、B组和C组所有血清型的VP1基因保守区域设计的序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示的引物对和序列如SEQIDNo.3所示的探针，针对柯萨奇病毒A组16型(CA16)的VP1基因保守区域设计的序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的引物对和序列如SEQIDNo.6所示的探针，针对肠道病毒71型(EV71)的VP1基因保守区域设计的序列如SEQIDNo.7、SEQIDNo.8所示的引物对和序列如SEQIDNo.9所示的探针。优选的，针对肠道病毒中A组、B组和C组所有血清型的探针两端的标记分别为FAM和BHQ1标记；针对柯萨奇病毒A组16型的探针两端的标记分别为HEX和BHQ1标记；针对肠道病毒71型两端的标记分别为CY5和BHQ1标记。具体如下：第一组引物和探针包括：引物名称引物序列(5’-3’)ENV-F(SEQIDNo.1)CCCTGAATGCGGCTAATCCENV-R(SEQIDNo.2)ATTGTCACCATAAGCAGCCAENV-P(SEQIDNo.3)AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC探针(SEQIDNo.3)两端分别为FAM和BHQ1标记。第二组引物和探针包括：引物名称引物序列(5’-3’)CA16-F(SEQIDNo.4)AGATGTGTGTTGAACCATCACTCYACCA16-R(SEQIDNo.5)TGTGTACCCGTGGTGGGCATCA16-P(SEQIDNo.6)ACAGCCATTGGGAAYTTCTTYAGCCGTGC探针(SEQIDNo.6)两端分别为HEX和BHQ1标记。第三组引物和探针包括：探针(SEQIDNo.9)两端分别为CY5和BHQ1标记。第二方面，本专利技术涉及一种肠道病毒分型鉴定试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术所述的rRT-PCR引物和探针组合。优选的，所述试剂盒用于：鉴定或辅助鉴定待测病毒为肠道病毒，并鉴定该肠道病毒是CA16血清型或EV71血清型；或鉴定待测样本是否感染肠道病毒，如是，该肠道病毒是CA16血清型或EV71血清型。第三方面，本专利技术涉及一种本专利技术所述的rRT-PCR引物和探针组合的应用，包括：鉴定或辅助鉴定待测病毒为肠道病毒，且鉴定该肠道病毒是CA16血清型或EV71血清型；或制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒为CA16血清型或EV71血清型肠道病毒的试剂盒；或鉴定待测样本是否感染了肠道病毒，如是，该肠道病毒是CA16血清型肠道病毒或EV71血清型肠道病毒；或制备用于鉴定待测样本是否感染了CA16血清型或EV71血清型肠道病毒的试剂盒。第四方面，本专利技术涉及一种非诊断目的的应用本专利技术所述的rRT-PCR引物和探针组合进行肠道病毒分型鉴定的方法，所述方法包括如下步骤：S1、利用核酸提取试剂从待测肠道病毒样本中提取RNA；S2、加入所述引物和探针组合进行一步法rRT-PCR核酸扩增反应，其中引物终浓度为400nM，探针终浓度为100nM；S3、根据Ct值判断是否是肠道病毒阳性，并根据阳性结果荧光标记的不同判断是CA16血清型还是EV71血清型。优选的，步骤S3中，Ct值小于38的判断为阳性。优选的，步骤S3中，FAM通道阳性的可判断鉴定结果为肠道病毒阳性；HEX通道阳性的可判断分型结果为肠道病毒CA16阳性，CY5通道阳性判断分型结果为EV71阳性。即FAM标记阳性时表示肠道病毒阳性，若HEX标记阳性时则表示肠道病毒CA16血清型阳性，若CY5标记阳性时则表示肠道病毒EV71血清型阳性。优选的，所述一步法rRT-PCR核酸扩增反应的反应条件为：45℃，10分钟，1个循环；95℃，2分钟，1个循环；95℃，5秒，60℃，20秒，40个循环。本专利技术针对肠道病毒以及肠道病毒常见两种血清型CA16和EV71的VP1基因保守区域设计了6条引物和3条Taqman探针，如SEQIDNo.1-SEQIDNo.9。并在探针采用不同的应该光标记，简化了后续的分型鉴定应步骤。同时公开了待检样本的处理、rRT-PCR反应体系及反应条件及结果判定标准。本专利技术可以实现对我国大陆流行的肠道病毒以及两种主要血清型肠道病毒流的检测及分型鉴定，操作简单、应用方便，为肠道感染病原学和临床流行病学研究提供了可行的技术方法。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：本专利技术所述的肠道病毒rRT-PCR引物和探针位于肠道病毒及肠道病毒常见两种血清型CA16和EV71的VP1基因相对保守区域，不同血清型的Taqman探针选择不同的荧光标记，简化检测步骤，减少反应体系配置，可在同一管检测反应体系中实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种rRT‑PCR引物和探针组合，其特征在于，包括针对肠道病毒中A组、B组和C组所有血清型的VP1基因保守区域设计的序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ ID No.3所示的探针，针对柯萨奇病毒A组16型的VP1基因保守区域设计的序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的引物对和序列如SEQ ID No.6所示的探针，针对肠道病毒71型的VP1基因保守区域设计的序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的引物对和序列如SEQ ID No.9所示的探针。

【技术特征摘要】
1.一种rRT-PCR引物和探针组合，其特征在于，包括针对肠道病毒中A组、B组和C组所有血清型的VP1基因保守区域设计的序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示的引物对和序列如SEQIDNo.3所示的探针，针对柯萨奇病毒A组16型的VP1基因保守区域设计的序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的引物对和序列如SEQIDNo.6所示的探针，针对肠道病毒71型的VP1基因保守区域设计的序列如SEQIDNo.7、SEQIDNo.8所示的引物对和序列如SEQIDNo.9所示的探针。2.根据权利要求1所述的rRT-PCR引物和探针组合，其特征在于，针对肠道病毒中A组、B组和C组所有血清型的探针两端的标记分别为FAM和BHQ1标记；针对柯萨奇病毒A组16型的探针两端的标记分别为HEX和BHQ1标记；针对肠道病毒71型两端的标记分别为CY5和BHQ1标记。3.一种肠道病毒分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的rRT-PCR引物和探针组合。4.如权利要求3所述的肠道病毒分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于：鉴定或辅助鉴定待测病毒为肠道病毒，并鉴定该肠道病毒是CA16血清型或EV71血清型；或鉴定待测样本是否感染肠道病毒；如是，鉴定该肠道病毒是CA16血清型或EV71血清型。5.一种如权利要求1或2所述的rRT-PCR引物和探针组合的应用，其特征在于，包括：鉴定或辅助鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱兆奎，李晓丹，赵百慧，
申请(专利权)人：上海伯杰医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31