人源化基因改造动物模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及人源化基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化CD137基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Preparation and application of humanized gene modification animal model

The invention relates to humanized genetically modified non-human animals, in particular genetically modified rodents, but in particular genetically modified mice, in particular to the construction method of humanized CD137 gene animal model and its application in the field of biomedicine.

【技术实现步骤摘要】
人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化CD137基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(ScheerN,SnaithM,WolfCR,SeiblerJ.Generationandutilityofgeneticallyhumanizedmousemodels,DrugDiscovToday；18(23-24):1200-11,2013)。免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的共刺激分子为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向抑制性受体CTLA-4、PD-1/PD-L1及其配体的单克隆抗体已经取得确切疗效，已有药品上市并获批多个适应症。但病人的应答率较低，且不能充分满足临床需求，更多靶向其它的T细胞的共刺激分子的新型药物正在或已经进入临床研究。CD137(4-1BB)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族中的诱导型T细胞表面分子，含有3个N-糖基化位点和潜在的O-糖基化位点，由胞外区、跨膜区和胞浆内区组成，为I型跨膜蛋白，主要表达在T细胞、NK细胞、中性粒细胞和DC细胞表面。人CD137基因定位于1P36，NCBI基因ID为3604，编码含255个氨基酸的蛋白质，其cDNA与鼠CD137cDNA有60％的同源性。CD137蛋白分子可有两种形式：膜结合型和可溶性两种活性形式，分别由2.8kb和1.4kbmRNA编码，但后者缺乏跨膜区。鼠CD137基因定位于4E2，NCBI基因ID为21942。CD137唯一的受体CD137L属于TNF超家族，表达在抗原递呈细胞表面，包括DC细胞、B细胞和巨噬细胞。已有研究表明CD137及其受体CD137L相互作用产生的协同刺激信号，可诱导T细胞和NK细胞的活化、增殖和细胞因子的产生等其他一些功能。CD137及其配体在肿瘤组织中呈现异常表达，表明在肿瘤发生过程中可能存在CD137及其配体的共刺激信号破坏或无活性，从而促进肿瘤的产生。大量研究表明CD137是极具潜力的抗肿瘤生物治疗靶点之一。到目前为止，已有两个针对CD137通路的抗体(BMS的BMS663513和辉瑞的PF-05082566)在进行临床I/II期试验，主要针对黑色素瘤、淋巴癌、非霍奇金淋巴瘤和一些晚期实体瘤。部分临床试验已经有了初步的临床结果，并显示出临床应用潜力。例如PF-05082566能使40％的滤泡性淋巴瘤(FL)缩小，副作用也很小，与PD-1抑制剂效果相当；此外也有和其他一些药物的连用，包括靶向药和PD-1抗体、OX40抗体激动剂。有初步的试验证据表明，靶向药物会增加NK细胞表面的CD137表达，如果同时能够加入CD137的激活抗体，就会增强NK细胞的杀瘤功能，提高治疗效果。然而，虽然有抗肿瘤活性，应用BMS663513治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的试验已因严重的肝毒性被终止。ByoungS.Kwon等人(2002年)为了研究CD137在免疫中的生理作用，使用ES方法通过破坏CD137基因的ATG区域，通过回交后成功制备了CD137-/-小鼠(C57BL/6背景)。该小鼠可正常发育且各器官组织具有正常大小和重量，但由于缺失CD137，该小鼠T细胞的免疫应答降低(表现为细胞因子分泌能力降低)，且细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性降低。但该小鼠可发展自身免疫，表明CD137在免疫系统中维持稳态中发挥作用。此外还发现CD137/CD137L信号似乎在调节骨髓祖细胞(myeloidprogenitorcell)生长中也起作用(KwonBSect.,Immuneresponsesin4-1BB(CD137)-deficientmice，Journalofimmunology,2002Jun1；168(11):5483-90)。他们进一步使用该小鼠与BALB/c小鼠和Rag2-/-小鼠交配，分别得到CD137-/-小鼠(BALB/c背景)和Rag2-/-CD137-/-小鼠(C57BL/6背景)，用于研究CD137在DC细胞上的表达和功能。发现缺失CD137的小鼠体内DC细胞可以正常成熟，但成熟后细胞存活较差、寿命短；且发现体内(invivo)由于缺乏CD137，CD4+T细胞增殖明显减少(BeomK.Choiect.，4-1BBfunctionsasasurvivalfactorindendriticcells，Journalofimmunology,2009Apr1；182(7):4107–4115.)。MarkA.DeBenedette等人(1999)使用ES方法制备了CD137L-/-小鼠(C57BL/6背景)，并对淋巴结和脾脏的T细胞和B细胞进行对比，发现其CD4+和CD8+T细胞和B细胞及CD8+DC细胞的分布及数量与野生型小鼠几乎一致，但其对流感病毒的记忆CTL应答受损(MarkA.DeBenedette，Analysisof4-1BBLigand(4-1BBL)-DeficientMiceandofMiceLackingBoth4-1BBLandCD28RevealsaRolefor4-1BBLinSkinAllograftRejectionandintheCytotoxicTCellResponsetoInfluenzaVirus，TheJournalofImmunologyNovember1,1999vol.163no.94833-4841)。Middendorp等人(2009)进一步研究发现该CD137L-/-小鼠容易发生B细胞淋巴瘤，在12月龄小鼠的发生率约为60％，分析其机制可能为CD137基因缺失诱发诸如BCL-10及GC应答调控分子BCL-6等的过表达(SabineMiddendorpect.,MicedeficientforCD137ligandarepredisposedtodeve本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自CD137基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自CD137基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸。

【技术特征摘要】
2016.12.30 CN 2016112567074;2017.09.25 CN 201710871.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自CD137基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自CD137基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。2.根据权利要求1所述的靶向载体，其特征在于，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000070.6的第150924999-150929845位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂，其选自如所示的NCBI登录号为NC_000070.6的第150935815-150940542位核苷酸。3.根据权利要求1或2所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于Cd137基因第2号外显子至第7号外显子。4.根据权利要求1-3任一所述的靶向载体，其特征在于，所述靶向载体还包括可选择的基因标记和/或阳性克隆筛选的抗性基因和/或特异性重组系统。5.根据权利要求1-4任一所述的靶向载体，其特征在于，其中插入或替换的供体DNA序列片段来自人；优选的，所述插入或替换的供体DNA序列为人CD137基因的核苷酸序列部分或全部。6.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1-5任一所述的靶向载体。7.权利要求1-5任一所述的靶向载体、权利要求6所述的细胞在构建包含CD137基因人源化的非人动物或其子代中的应用。8.一种制备CD137基因人源化非人动物或其子代的方法，其特征在于，包括导入人CD137基因，使得该人CD137基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的CD137蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的CD137蛋白的表达。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括将动物来源的Cd137的全部或部分替换为人CD137的全部或部分。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括将动物来源的Cd137的第2-7号外显子全部或部分替换为人CD137的第3-8号外显子的全部或部分序列。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，使用权利要求1-5任一所述的靶向载体或权利要求6所述的细胞将动物来源的Cd137的第2-7号外显子全部或部分替换为人CD137的第3-8号外显子的全部或部分序列。12.根据权利要求8-11任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)使用权利要求1-5任一所述的靶向载体靶向细胞中的目标基因组以形成经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞或提供权利要求6所述的细胞；优选的所述非人类哺乳动物细胞为胚胎干细胞；(b)将所述细胞在培养液中进行培养；(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性动物的后代基因改造人源化动物中的种系传递。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行CD137基因人源化非人动物或其子代的建立，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于胚胎干细胞的基因同源重组技术进行CD137基因人源化非人动物或其子代的建立。14.根据权利要求8-13任一所述的方法，其特征在于，所述动物是啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。15.根据权利要求8-14任一所述的方法，其特征在于，所述动物用作动物模型；优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。16.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述人源化的CD137蛋白的氨基酸序列选自：a)所述氨基酸序列如SEQIDNO：24所示；b)所述氨基酸序列与SEQIDNO：24所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在严格条件下，与编码SEQIDNO：24所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；d)所述氨基酸序列与SEQIDNO：24所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；和/或e)所述氨基酸序列具有SEQIDNO：24所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。17.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，编码所述人源化的CD137蛋白的基因序列选自：a)所述基因编码权利要求16中所述人源化CD137氨基酸序列；b)所述基因的mRNA序列如SEQIDNO：23所示；c)所述基因的CDS编码序列如SEQIDNO：22所示；d)在严格条件下，与SEQIDNO：22或SEQIDNO：23或SEQIDNO：25所示的核苷酸杂交的基因序列；e)与SEQIDNO：22或SEQIDNO：23或SEQIDNO：25所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；f)编码氨基酸的基因序列，所述氨基酸与SEQIDNO：24所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；g)编码氨基酸的基因序列，所述氨基酸的序列与SEQIDNO：24的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基；和/或h)编码氨基酸的基因序列，所述氨基酸具有SEQIDNO：24所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。18.根据权利要求8-17任一所述的方法制备获得的非人动物或其子代。19.一种制备多基因人源化非人动物的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)利用权利要求18所述的非人动物或其子代；(b)将步骤(a)获得的动物与其他人源化动物交配或进行体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物。20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多基因人源化非人动物为双基因人源化动物；优选的，所述其他人源化动物为PD-1人源化动物或PD-L1人源化动物；更优选的，所述动物为小鼠。21.根据权利要求19或20所述的方法制备获得的多基因人源化非人动物或其子代。22.一种嵌合CD137蛋白，其特征在于，所述嵌合CD137的氨基酸序列选自：a)所述氨基酸序列如SEQIDNO：24所示；b)所述氨基酸序列与SEQIDNO：24所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，郭雅南，白阳，赵磊，黄蕤，姚佳维，张美玲，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11