本发明专利技术公开了一组能特异性识别不同生长时期的大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体，属于食品安全生物技术领域。本发明专利技术应用Whole cell‑SELEX技术，以不同生长时期的大肠杆菌O157:H7为靶标，经过14轮的反复筛选、亲和力和特异性试验的分析验证，获得了一组针对不同生长时期大肠杆菌O157:H7亲和性和特异性均良好的核酸适配体。该适配体在准确、快速、灵敏检测食品中大肠杆菌O157:H7方面具有广泛的应用前景。
A set of oligonucleotide aptamers specifically identifying Escherichia coli O157:H7 in different growth stages
The invention discloses a group of oligonucleotide aptamers that can specifically recognize E. coli O157:H7 in different growth stages, belonging to the field of food safety biotechnology. By using Whole cell SELEX technique and taking Escherichia coli O157:H7 at different growth stages as the target, a group of nucleic acid aptamers with good affinity and specificity for Escherichia coli O157:H7 at different growth stages were obtained after 14 rounds of repeated screening, affinity and specificity tests. The aptamer has a broad application prospect in the accurate, rapid and sensitive detection of E. coli O157:H7 in food.
【技术实现步骤摘要】
一组特异性识别不同生长时期大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体
本专利技术涉及食品安全生物
，尤其是涉及一种利用分子生物学技术中的SELEX技术(即指数富集的配体系统进化技术)筛选能特异性识别不同生长时期大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体。
技术介绍
大肠杆菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7，E.coliO157:H7)是肠出血性大肠杆菌(EnteroheamorrhagicEscherichiacoli，EHEC)致病性大肠杆菌主要的致病菌株。它是一种无芽孢、有鞭毛、具有较强耐酸性且耐低温的革兰氏阴性杆菌，主要传播方式是被粪便污染的食物。大肠杆菌0157:H7毒性极强，少于50个病原菌就可传染，表现出血性肠炎、溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等症状，死亡率高。近40年以来，大肠杆菌0157:H7中毒事件频有发生，造成了人员的死亡和大量的经济损失，因此，实现食品中大肠杆菌0157:H7准确、快速、灵敏地检测，对于预防大肠杆菌0157:H7的暴发传染、保障食品安全和保护人类健康都有极其重要的意义。大肠杆菌O157:H7常用的检测方法包括传统平板分离培养和生理生化鉴别法、ELISA法、PCR法、荧光定量PCR法、基因芯片法等，传统的细菌培养和生化鉴定操作繁琐、耗时；PCR方法虽然快速、准确，但其影响因素复杂，且易受操作条件的影响，重复性差且无法保证其特异性；ELISA法具有特异性强、准确、灵敏的特点，但制备特异性抗体的过程复杂，耗时长，制备出的抗体稳定性差，而且检测仪器昂贵，检测灵敏度低(一般为105cfu/mL)。适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)从体外合成的随机核苷酸序列文库中筛选获得能够特异性识别结合靶标的一段短的单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)或核糖核苷酸(RNA)序列，具有靶分子范围广、高亲和力和高特异性、筛选周期短的显著特点，与抗体相比合成方便，成本低，易标记各种功能基团，不易受温度等环境因素影响，可以在长期保存过程保持很好的稳定性。这些独特优势使适配体在化学分析、医药和食品安全等领域具有广阔的应用前景。Cell-SELEX筛选是一种基于完整细菌细胞为靶物质的筛选方法，将细菌悬浮液通过离心沉淀从而分离出结合和未结合的寡核普酸分子。近几年，已成功采用Cell-SELEX技术筛选出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌等细菌的适配体，基于Cell-SELEX技术筛选病原致病菌、肿瘤细胞等细胞的适配体已经成为当前的研究热点。CN106929510A提供了一种大肠杆菌O157:H7的特异性核酸适配体及应用。但是该适配体只能特异性识别对数时期大肠杆菌，并且适配体解离常数Kd为82.45±18.46nM，检测限为90cfu/mL，还不能满足检测要求。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一组特异性识别不同生长时期大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体。本专利技术以不同生长时期的大肠杆菌O157:H7为靶标，采用Cell-SELEX技术筛选出能特异性识别不同生长时期大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体，具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，将广泛应用于食品中大肠杆菌O157:H7的快速检测；并且为该核酸适配体在检测食品中、环境中大肠杆菌O157:H7的应用提供科学依据和理论基础。本专利技术的技术方案如下：本申请提供了一组能同时识别调整期、对数期和稳定期的大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体，所述适配体的寡核苷酸序列为序列3、序列4所示的寡核苷酸序列。可以在所述寡核苷酸适配体的5’端或3’端标记FAM、琉基基团、FITC、生物素。单独或联合使用修饰或不修饰所述寡核苷酸适配体均能用于不同时期大肠杆菌O157:H7的分析检测。本申请还提供了所述的寡核苷酸适配体在食品和临床医学中检测大肠杆菌O157:H7方面的应用。本专利技术有益的技术效果在于：本专利技术方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以不同生长时期的大肠杆菌O157:H7为靶标，筛选获得两条与靶细胞高亲和性、高特异结合的适配体Apt-4和Apt-5，可以通过荧光基团标记方法将获得的适配体转为检测探针，用于环境样品、食品中大肠杆菌O157:H7的检测，达到快速、准确诊断的目的。与抗体相比，适配体可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。本专利技术序列是从结构显著、与大肠杆菌O157:H7结合具有不同亲和力的9条适配体序列中选取出的亲和力和特异性均较强的适配体序列，能够特异识别三种不同生长阶段(调整期、对数期、稳定期)的大肠杆菌O157:H7。与识别单一生长时期的大肠杆菌O157:H7适配体相比，本专利技术序列能够识别处于调整期、对数期以及稳定期三种不同时期的大肠杆菌O157:H7，具有靶标范围更广的特点，能够更灵敏地检测出环境中、食品中存在的大肠杆菌O157:H7。本专利技术适配体Apt-5的检测限为：调整期检测限为16cfu/mL、对数期检测限为12cfu/mL、稳定期检测限为16cfu/mL。附图说明图1为基于Cell-SELEX技术筛选大肠杆菌O157:H7核酸适配体的原理图；图2为大肠杆菌O157:H7的生长曲线图；图3为从大肠杆菌O157:H7的9个适配体家族代表性序列中挑选出的5条Kd值较低的适配体二级结构图谱；图4为大肠杆菌O157:H7适配体Apt-1、Apt-3、Apt-4、Apt-5、Apt-7亲和力饱和结合曲线；图5为大肠杆菌O157:H7适配体Apt-1、Apt-3、Apt-4、Apt-5、Apt-7的特异性图；图6为大肠杆菌O157:H7适配体Apt-4、Apt-5与三种不同时期(调整期、对数期、稳定期)的细菌流式分析图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和具体实施例，通过Cell-SELEX技术筛选高特异亲和的大肠杆菌O157:H7核酸适配体及其快速检出大肠杆菌O157:H7的方法(即图1所示原理和步骤)，对本专利技术所述技术方案作进一步的详细说明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂、耗材如无特殊说明均未常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。实施例1：筛选适配体1、合成随机单链DNA文库和引物(由美国工IntegratedDNATechnologies公司完成)随机ssDNA文库：5’-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-N40-GGCAGGTCTACTTTGGGATC-3’5’羧基荧光素标记上游引物：5’-FAM-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-3’5’磷酸化下游引物：5’-P-GATCCCAAAGTAGACCTGCC-3’将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100uM贮存液存于-20℃备用。2、菌种的选取与处理(1)大肠杆菌O157:H7生长曲线的测定将大肠杆菌O157:H7置于LB(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4)液体培养基中培养，37℃，120r/min摇床培养，每隔一段时间测一次菌液的OD值。根据每一段时间的数值作出其生长曲线图(如图2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.能同时识别调整期、对数期和稳定期的大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体，其特征在于所述适配体的序列为序列3或序列4所示的寡核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.能同时识别调整期、对数期和稳定期的大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体，其特征在于所述适配体的序列为序列3或序列4所示的寡核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸适配体，其特征在于所述寡核苷酸适配体5’端或3’端标记FAM、琉基基团、...
【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，邹颖，段诺，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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