一种适配子结合蛋白的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种可以特异、灵敏地检测适配子结合蛋白的分析方法。该方法通过识别探针去招募结合蛋白，利用DNA双链杂交的方式将光交联基团引入到结合蛋白，并通过光引发将结合蛋白共价键合到捕捉探针上，实现了适配子结合蛋白的高效鉴定。本方法解决了由于适配子与结合蛋白作用力较弱，适配子结合蛋白难以鉴定的问题，适用于丰度较低的、结合力较弱的适配子互作蛋白分析。本发明专利技术的探针合成过程简单、选择性好、灵敏度高，可以实现对实际体系中适配子结合蛋白的特异性检测与富集。

A method for detecting aptamer binding protein

The invention relates to an analytical method for detecting aptamer binding proteins specifically and sensitively. By identifying probes to recruit binding proteins and introducing Photocross-linking groups into binding proteins by DNA double strand hybridization, the binding proteins were covalently bonded to capture probes by photoinitiation, thus enabling efficient identification of aptamer-binding proteins. This method solves the problem that aptamer binding proteins are difficult to identify because of the weak interaction between aptamer and binding proteins, and is suitable for the analysis of aptamer interaction proteins with low abundance and weak binding power. The probe has the advantages of simple synthesis process, good selectivity and high sensitivity, and can realize the specific detection and enrichment of aptamer binding proteins in the actual system.

【技术实现步骤摘要】
一种适配子结合蛋白的检测方法
本专利技术涉及生物化学和生物医学检测
，尤其是涉及适配子结合蛋白的检测与鉴定，特别是涉及到溶菌酶的检测和鉴定。
技术介绍
蛋白质是生命体的重要物质基础，尤其是与疾病相关的生物标志物的鉴定对于疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。基于适配子的“钓鱼”技术在疾病相关的生物标记物的检测中逐渐发展起来。利用适配子作为“诱饵”，在其末端修饰报告基团，如用于生物成像的荧光基团或用于亲和富集的生物素，将修饰有报告基团的适配子与复杂的蛋白体系孵育，找到与适配子特异性结合的蛋白等生物标记物，然后通过报告基团对蛋白进行亲和富集或者荧光标记，最后通过质谱等对蛋白进行定性及定量分析。适配子(aptamer)是一段人工合成的单链DNA或RNA，可以通过非常成熟的指数级富集配子系统进化(SELEX)技术从特定的寡核苷酸库中筛选出来，对某种特定的靶标具有特异性识别。它具有一定的空间结构，可以特异性地识别蛋白、小分子以及复杂的细胞、组织等。由于适配子具有亲和力强、特异性好、稳定性好、易改造修饰、快速合成等优点，作为生物探针在生命科学、临床诊断、药物发现和环境科学等方面可以部分取代抗体的作用。传统的适配子为诱饵的蛋白质捕获技术难以捕捉分子间弱的以及暂时的相互作用，并且在复杂的洗脱过程中容易损失蛋白。因此发展出一种光交联技术，在适配子上修饰光交联基团，通过紫外光照引发光交联，使适配子与蛋白质之间的弱作用力转化为强的共价键作用，以解决上述问题。然而，光交联基团对适配子骨架的修饰通常会影响适配子的结构，进而影响适配子对目标蛋白的识别特性。另外，由于化学合成技术的限制，光交联基团只能被修饰到适配子DNA链上有限几种不同的碱基上且合成步骤繁琐，无法灵活地改变光交联基团与目标蛋白之间的相对位置，使得该分析方法具有一定的局限性。目前也有很多基于适配子检测或识别蛋白质的其他方法出现，例如表面等离子体共振、原子力、电化学发光等等。但在采用适配子检测时，如何控制检测并避免修饰官能团对蛋白质与适配子间识别与互作的干扰，是提高检测方法的灵敏性和特异性需要解决的关键技术。溶菌酶是一种由多形核白细胞分泌的抗菌蛋白质，又称为N‐乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N‐乙酰胞壁酸和N‐乙酰氨基葡糖之间的β‐1,4糖苷键，导致细胞壁破裂、内容物逸出而使细菌溶解。并且，溶菌酶可以与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。此外，溶菌酶还是多种动物组织的内源性免疫系统的重要组成部分。该酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的唾液、泪液、气管分泌物等中，而且在不同组织其正常含量也各不相同。溶菌酶在人体液中的浓度在临床上可以作为许多疾病诊断的辅助标志，例如口咽部念珠菌感染的病人唾液中的溶菌酶浓度会升高；肾病患者的尿液中会出现溶菌酶；血液、脑脊髓液中溶菌酶的浓度是白血病和中枢神经系统肿瘤疾病的重要辅助诊断依据；新生儿体内溶菌酶缺乏可能会导致支气管性肺发育障碍等等。因此对于溶菌酶的检测在临床诊断学上具有重要的辅助诊断意义。目前溶菌酶检测的常见方法有凝胶电泳法、高效液相色谱法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法、电化学检测方法等，但由于人体液中溶菌酶的浓度较低，通常只有10‐7mol·L‐1，采用这些方法检测前，一般需要先对溶菌酶进行富集、分离和提取，使得整个检测方法操作复杂，成本高。因此需要开发能直接适用于复杂样品体系的，无需事前对溶菌酶进行富集、分离和提取操作的溶菌酶检测方法。
技术实现思路
本专利技术旨在针对目前适配子结合蛋白的检测中存在的上述问题，提供一种稳定、灵敏、特异性检测适配子结合蛋白的方法和试剂。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的第一个方面是提供一种双探针。根据本专利技术，所述双探针包括识别探针和捕捉探针，所述识别探针是单链寡核苷酸，包括串联连接的适配子序列和被捕捉序列；所述捕捉探针包括捕捉序列以及修饰在捕捉探针上的光交联基团和报告基团，所述捕捉序列是单链寡核苷酸。识别探针上的适配子序列用于识别并结合适配子结合蛋白，捕捉探针的捕捉序列识别识别探针上的被捕捉序列，并通过碱基互补作用与识别探针的被捕捉序列结合。在本专利技术的一些实施方式中，所述识别探针的被捕捉序列为5’‐ATGTCGCTGTAG‐3’；所述捕捉探针的捕捉序列为5’‐CTACAGCGACAT‐3’。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述适配子序列为5’‐ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAG‐3’，该适配子序列能识别并结合溶菌酶。根据本专利技术，在一些情况下，所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的3’端，并且光交联基团位于捕捉探针的3’端，报告基团位于捕捉探针的5’端。在另一些情况下，所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的5’端，并且光交联基团位于捕捉探针的5’端，报告基团位于捕捉探针的3’端。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述识别探针为：5’‐ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAGATGTCGCTGTAG‐3’。该序列包含从5’端起的能够识别溶菌酶的30个碱基的适配子序列，以及12个碱基的被捕捉序列，这12个碱基的被捕捉序列用于与捕捉探针中的捕捉序列进行后续寡核苷酸自组装，其序列不会与适配子序列的碱基互补，因而不影响适配子的空间结构。该识别探针的作用是识别溶菌酶。进一步，根据本专利技术，所述捕捉探针的捕捉序列和光交联基团之间具有延长臂序列，延长臂序列用于将捕捉探针上的光交联基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，使光交联基团从空间上接近被识别探针结合的适配子结合蛋白。在一些实施方式中，所述延长臂序列为‐Y‐(CH2)6‐，其中Y为含有n个碱基的短序列，n为0‐12的整数，并且‐Y‐与捕捉序列相连，‐(CH2)6‐与光交联基团连接。Y的碱基选择只要使延长臂序列不与捕捉探针上的其他序列产生互补，不与识别探针产生互补即可。在一些实施方式中，n为0‐9，例如0，3，6，或9，优选为3。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述延长臂序列为‐TTG‐(CH2)6‐。进一步，根据本专利技术，所述捕捉探针的捕捉序列和报告基团之间具有悬臂序列，悬臂序列用于将捕捉探针上的报告基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，以提供充足空间使报告基团伸展，例如生物素等更好的伸展以及与链霉亲和素beads等的结合。在一些实施方式中，所述悬臂序列为‐Z‐，其中Z为含有m个碱基的序列，m为大于等于0的任意整数。Z的碱基选择只要使悬臂序列不与捕捉探针上的其他序列产生互补，不与识别探针产生互补即可。在一些实施方式中，m为0‐9，例如0，3，6，9，优选为6。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述悬臂序列为TTTTTT。进一步，在本专利技术的优选方式中，所述捕捉探针在捕捉序列和光交联基团之间具有延长臂序列，并且在捕捉序列和报告基团之间具有悬臂序列。在本专利技术的一些实施方式中，所述捕捉探针为5’‐报告基团‐Z‐CTACAGCGACAT‐Y‐(CH2)6‐X‐光交联基团，Y为含有n个碱基的短序列，n为0‐12的整数；Z为含有m个碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双探针，包括识别探针和捕捉探针，其特征在于：所述识别探针是单链寡核苷酸，包括串联连接的适配子序列和被捕捉序列；所述捕捉探针包括捕捉序列以及修饰在捕捉探针上的光交联基团和报告基团，所述捕捉序列是单链寡核苷酸；识别探针上的适配子序列用于识别并结合适配子结合蛋白，捕捉探针的捕捉序列用于识别识别探针上的被捕捉序列，并通过碱基互补作用与识别探针的被捕捉序列结合；所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的3’端，并且光交联基团位于捕捉探针的3’端，报告基团位于捕捉探针的5’端；或者所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的5’端，并且光交联基团位于捕捉探针的5’端，报告基团位于捕捉探针的3’端。

【技术特征摘要】
1.一种双探针，包括识别探针和捕捉探针，其特征在于：所述识别探针是单链寡核苷酸，包括串联连接的适配子序列和被捕捉序列；所述捕捉探针包括捕捉序列以及修饰在捕捉探针上的光交联基团和报告基团，所述捕捉序列是单链寡核苷酸；识别探针上的适配子序列用于识别并结合适配子结合蛋白，捕捉探针的捕捉序列用于识别识别探针上的被捕捉序列，并通过碱基互补作用与识别探针的被捕捉序列结合；所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的3’端，并且光交联基团位于捕捉探针的3’端，报告基团位于捕捉探针的5’端；或者所述识别探针的被捕捉序列位于适配子序列的5’端，并且光交联基团位于捕捉探针的5’端，报告基团位于捕捉探针的3’端。2.如权利要求1所述的双探针，其特征在于，所述识别探针的被捕捉序列为5’‐ATGTCGCTGTAG‐3’；所述捕捉探针的捕捉序列为5’‐CTACAGCGACAT‐3’。优选所述的适配子序列为5’‐ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAG‐3’。3.如权利要求1或2所述的双探针，其特征在于，所述识别探针为：5’‐ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAGATGTCGCTGTAG‐3’。4.如权利要求1‐3任一项所述的双探针，其特征在于，所述捕捉探针的捕捉序列和光交联基团之间具有延长臂序列，延长臂序列用于将捕捉探针上的光交联基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，使光交联基团从空间上接近被识别探针结合的适配子结合蛋白。优选延长臂序列为‐Y‐(CH2)6‐，其中Y为含有n个碱基的短序列，n为0‐12的整数，‐Y‐与捕捉序列相连，‐(CH2)6‐与光交联基团连接。优选n为0‐9，更优选n为3。优选所述延长臂序列为‐TTG‐(CH2)6‐。5.如权利要求1‐4任一项所述的双探针，其特征在于，所述捕捉探针的捕捉序列和报告基团之间具有悬臂序列，悬臂序列用于将捕捉探针上的报告基团“悬挂”在识别探针被捕捉序列和捕捉探针捕捉序列形成的双链结构之外，以提供充足空间使报告基团伸展。优选所述悬臂序列为‐Z‐，其中Z为含有m个碱基的序列，m为大于等于0的任意整数。优选m为3‐9，更优选为6。优选所述悬臂序列为TTTTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张锴，柏雪，毕文静，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：天津,12