一种普鲁兰酶及其应用制造技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，具体涉及一种普鲁兰酶及其制备与应用。所述普鲁兰酶其编码基因是使用易错PCR技术，对野生型普鲁兰酶基因进行随机突变获得的，得到普鲁兰酶突变体PLUM，酶活较野生型普鲁兰酶的酶活提高了57.03％。

A prululan enzyme and its application

The invention belongs to the field of enzyme engineering technology, in particular to a pullulan enzyme and its preparation and application. The prullase gene was obtained by random mutation of the wild-type prulan enzyme gene by using the error PCR technique. The prululan mutant PLUM was obtained, and the enzyme activity of the enzyme activity was 57.03% higher than that of the wild prulan enzyme.

【技术实现步骤摘要】
一种普鲁兰酶及其应用
：本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种普鲁兰酶及其制备与应用。
技术介绍
：普鲁兰酶，是一类淀粉脱支酶，能够水解多糖中的α-1,6糖苷键，使直链淀粉最大限度的转化为支链淀粉。它在淀粉加工工业中有着非常重要的用途，可大规模提高淀粉的利用率和生产效率，并较成熟的应用于葡萄糖浆、麦芽糖浆和啤酒生产中。在葡萄糖生产中，普鲁兰酶与葡萄糖淀粉酶一起用于糖化工序，普鲁兰酶的使用通过降低低聚糖含量而提高葡萄糖的得率，并且可减少葡萄糖淀粉酶的剂量。普鲁兰酶也可用于啤酒工业中，添加在糖化或发酵过程中来提高麦芽汁发酵能力。1961年，人们发现了第一株产普鲁兰酶的产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)，并报道了该酶良好的酶学特性。之后，各国科研人员经过广泛深入的研究发现了多种产普鲁兰酶的微生物。如，蜡状芽孢杆菌蕈状变种、嗜酸普鲁兰酶芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、耐热产硫梭菌等。但是目前发现的多数产普鲁兰酶的菌种均不具备工业价值。本专利技术将通过基因工程手段，提供一种高活力的普鲁兰酶。
技术实现思路
：为了实现上述目的，本专利技术提供一种普鲁兰酶突变体及其基因，本专利技术使用易错PCR技术，对来自嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(BacillusAcidopullulyticus)的普鲁兰酶编码基因pul进行随机突变，得到普鲁兰酶突变体基因pulm，突变体的比酶活较原始酶提高57.03％，将其在毕赤酵母中进行表达，得到高活力的普鲁兰酶。在本专利技术中采用如下定义：1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2、普鲁兰酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示普鲁兰酶突变体中突变的氨基酸。如Gly547Cys，表示位置547的氨基酸由原始普鲁兰酶的Gly替换成Cys，位置的编号对应于SEQIDNO：2中野生型普鲁兰酶的氨基酸序列编号。在本专利技术中，PUL表示原始普鲁兰酶(氨基酸序列如SEQIDNO：2所示)，PULM表示突变后的普鲁兰酶(氨基酸序列如SEQIDNO：4所示)；pul表示原始普鲁兰酶的基因(如SEQIDNO：1所示)，pulm表示突变后普鲁兰酶的基因(如SEQIDNO：3所示)。用于表达所述的普鲁兰酶突变体的宿主细胞为毕赤酵母SMD1168，表达载体为pGAPZαC。有益效果：1、本专利技术使用易错PCR技术，对野生型普鲁兰酶基因进行随机突变，得到普鲁兰酶突变体PULM，比酶活较野生型普鲁兰酶提高了57.03％。2、本专利技术提供的普鲁兰酶突变体的突变位点为今后普鲁兰酶的研究提供新的方向与启示。附图说明：图1易错PCR产物电泳图；其中，M为marker；plum为易错PCR产物；图2pGAPZαC-pulm双酶切验证图；其中，M为marker；载体为pGAPZαC-pulm双酶切产物。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。实施例1：嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(BacillusAcidopullulyticus)基因组DNA的获得野生型普鲁兰酶成熟肽基因pul来自申请人实验室保存的嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(BacillusAcidopullulyticus)，提取其基因组DNA，步骤如下：(1)从培养菌体的平板上挑取一环菌接种于培养基中，30℃，200rpm培养过夜；(2)将培养液12000r/min离心10min，收获菌体；(3)加入1mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0)、150μL溶菌酶溶液，在37℃下消化30min；(4)加入溶液Ⅱ300μL(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，倒置5分钟；(5)加入等体积溶液III(饱和苯酚：氯仿＝1：1)，混合均匀，室温12000r/min离心12min，将上清转移到另一干净EP管中，弃去下层有机相及蛋白沉淀；(6)反复抽提两次，再用等体积氯仿抽提一次，去除痕量苯酚；(7)加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心10min，弃去上清，用70％乙醇(500μL)洗涤2次；(8)将EP管倒置于滤纸上，晾干后用TE缓冲液溶解，-20℃保存备用。实施例2：普鲁兰酶突变体基因的获得1、随机突变使用TaKaRa公司的TaKaRaTaqPCR扩增酶，基于易错PCR技术进行随机突变，获得高活力普鲁兰酶基因；设计引物如下：上游P1(SEQIDNo.5)：5’-TAAGAAGGAGATATACCATGGACAGCACCAGTACCAAGGTCATC-3’下游P2(SEQIDNo.6)：5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTACTGCTTAAGGATCAAAGTGGAGA-3’扩增模板为实施例1获得的基因组DNA，其扩增的反应体系为：扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性60s；61℃退火60s，72℃延伸180s，反应30个循环；72℃保温10min；4℃保存。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，可看到约2800bp的条带(图1)。PCR扩增产物不需处理，可以立即用于载体构建，也可-20℃长期保存。2、表达载体线性化使用TaKaRa的常规限制性内切酶对pET-28a质粒进行线性化处理，体系如下：NcoI5μLXhoI5μL10*Kbuffer10μL0.1％BSA10μLpET-28a5μgddH2O补至100μL线性化条件：37℃保温3h；65℃保温20min；4℃保存。线性化产物可以立即用于载体构建，也可-20℃长期保存。3、载体构建使用Vazyme公司的ClonExpressII一步连接酶将易错PCR产物与线性化的pET-28a进行连接，构建pul突变体表达载体库。为保证足够的库容，同时进行5个连接反应，共计100μL连接体系。连接体系如下：5*CEIIbuffer4μLPCR产物112ng线性化载体110ngExnaseII2μLddH2O补至20μL注意：冰浴中配制上述反应体系。反应条件：37℃保温30min；4℃保温5min。反应完成后，可4℃短期保存，或-20℃长期保存。4、pul突变体表达菌株库构建将步骤3的突变体表达载体连接产物(20μL/个)，按如下方式转化表达菌株E.coliBL21：从-80℃中取出E.coliBL21感受态细胞(100μL/支)，置于冰上溶解，溶解后立即在无菌环境下将20μL连接产物加入100μL大肠杆菌感受态细胞BL21，冰上放置30min，42℃水浴热击90s，冰上冷却1.5min，加入900μLLB培养基，于37℃，200r/min预培养30min。3000rpm离心2min，弃600μL上清液，将菌体沉淀和剩余上清液通过移液器吹吸混匀，每100μL浓缩菌液涂布于含卡纳抗性的LB平板，每组做4个平行，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。最终获得20块pul突变体表达菌株库涂布平板，封口膜密封后，4℃短期存放。5、筛选高活力普鲁兰酶基因从20块pul突变体表达菌株库涂布平板上，挑选阳性转化子。挑取至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。2.权利要求1所述普鲁兰酶突变体的编码基因。3.权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述基因其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，班立桐，黄亮，孙宁，杨红澎，
申请(专利权)人：天津中天精科科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12