具有不耐热染料的组合物制造技术

本公开提供了一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。本公开进一步提供了采用这样的组合物的方法，以及包含用于形成这样的组合物的成分的试剂盒。

A composition with dyestuff

The present disclosure provides an aqueous composition containing purified heat-resistant polypeptides with biological activity, and purified water-soluble substances that are heat-resistant, absorbing light and / or showing fluorescence at a functional conformation at a permissible temperature, in which the maximum allowable temperature of the polypeptide is higher than the maximum allowable temperature of the substance. . The present disclosure further provides a method for adopting such a composition and a kit containing components for forming such a composition.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有不耐热染料的组合物本公开提供了一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。本公开进一步提供了采用这样的组合物的方法，以及包含用于形成这样的组合物的成分的试剂盒。专利技术背景本公开涉及可用于设置和进行生化或分子生物学反应，并监测其状态的方法中的工具。关于生化或分子生物学反应的准备工作特别包括组装期望反应的所有必要反应物的步骤。通常，生化或分子生物学反应发生在水溶液中。因此，首先提供作为分离的组分的不同反应物。必须将它们组合以形成反应混合物，即形成具有指定浓度的所选成分并且处于限定的其他条件下的组合物，以便在稍后允许发生期望的反应。将所述组分混合以形成水溶液中的期望的组合物。为此，可以将组分作为干燥物质或作为已经溶解的物质，添加至混合物。此外，可以将几个组分单独地放在一起，溶解并混合以形成试剂，并且随后可以将多个试剂组合并混合，以便形成用于期望反应的期望的组合物(反应混合物)。反应混合物通常从不同水溶液的组合，所述水溶液不具有明显(即可见)的特殊特征。因此，技术人员面临这样的任务，即仔细监测期望的反应混合物的所有必要反应物(组分，组分溶液)在一个反应容器或多个反应容器中的组装过程。例如，熟练的实验室操作员依赖于由容器(其中提供具体试剂储液)的标记提供的信息。但是，一旦试剂从所述容器取出并转移至反应容器中，所述试剂与相应标记的物理关联就丢失了。在没有任何进一步追踪措施的情况下，关于反应容器中的相应试剂的存在和身份的信息就丢失了。在此方面，追踪措施可以是特别的记录，表明已经将具体试剂储液的等分试样转移到具体的反应容器中。追踪措施的另一实例是存在于具体试剂并且可以通过光学方式(例如目视检查)确定的着色剂。一旦将具有着色剂的试剂添加到反应容器，所述着色剂指示相应试剂在容器中的存在。这个原理已经用于生物化学和分子生物学，特别是在使用聚合酶链式反应(PCR)的应用中。如在Pelt-Verkuil,Elizabethvan,Belkum,Alexvan,Hays,JohnP.(2008)“PrinciplesandTechnicalAspectsofPCRAmplification”,SpringerNetherlands(ISBN978-90-481-7579-6)中的“7.3TaqDNApolymeraseanditsmodifications”所报道的，一些制造商提供含有报道为惰性的红色染料的耐热DNA聚合酶或现成的PCR主混合物(mastermixes)，所述染料不干扰聚合酶活性、扩增的PCR产物的纯化，测序或进一步的下游加工应用。这些染料相关产品的商购可得的实例包括REDAccuTaq®、REDTaq®(Sigma)和RedHot®TaqDNAPolymerase(ThermoFisher)等。这样的产品充当追踪措施，是因为它们允许目测控制聚合酶或主混合物的真实添加和混合。此外，它们有助于PCR扩增产物在凝胶电泳上的目测追踪。实际上，这些染料充当对应于125个碱基对的DNA片段的分子量标记。作为用于可视地指示试剂是否存在于小瓶中的目的的惰性着色剂宣传的另一种染料是VisiBlue™(TATAABiocenter)。WO2015/054396公开了作为着色剂与qPCR主混合物一起用于实时PCR仪器的可见染料制剂。用于PCR的反应混合物是用于在设置后通过应用温度变化而启动的生化或分子生物学反应的实例。更普遍地，关于设置生化或分子生物学反应的方法，操作者期望反应混合物的组分保持以下趋势的条件：(i)化学稳定，(ii)不彼此反应，和(iii)对于将随后进行的期望反应，不变成功能失常的。为此目的，熟知且经常应用的条件包括低的环境温度，例如0℃和4℃的范围内的温度，其提供用于很多生化反应物的这种期望的条件。具体地，这种低温对于抑制起源于嗜温生物的酶的生物活性而言会是有利的。然而，来自耐热生物的很多酶可以在室温下操作，因为其催化活性在更高的温度下展现。因此，大量的设置生化或分子生物学反应的制备方法在比进行相应的适当反应的温度更低的温度下进行。技术上，期望将着色试剂作为第一液体组合物的标记组分，否则无法将第一液体组合物与可以和所述第一组合物混淆的其他液体组合物区分开。这样的着色试剂可有利地在将不同试剂组合在反应混合物中的手动执行的方法中充当目测对照。理想地，这种目测对照允许检验具体试剂是否已经存在于混合物中。除了目测对照之外，可调整而用于通过其他光学方式(特别是通过可自动化的方式)评估的着色试剂是期望的。考虑到混合物的目的是允许生化反应发生的事实，进一步期望对于所述生化反应而言，着色试剂是惰性的；也就是说，着色剂不应抑制或以其他方式不利地干扰使用所述混合物进行的生化反应。在生化反应的过程期间，对反应混合物的任何光学性质进行改变的具体情况下，期望对这种改变的检测不受所述着色剂的不利影响。在待进行的生化反应是包括监测热循环步骤期间的荧光发射的步骤的实时PCR的情况下，这是非常特异性的需求。在这点上的具体挑战是找到不使一种或多种荧光染料的荧光淬灭的着色试剂，所述荧光染料可作为指示PCR方法的进程和/或结果的检测系统的一部分存在于反应混合物中。仍另一个技术目标是由使用可由设备(包括但不限于用于实时PCR的热循环仪)生成的光度读数，将目测对照与自动化对照组合的期望所给出的。通过更广泛地关注于包括温度变化的生化反应，本公开的作者采用了搜索即便在低浓度下也具有容易对人眼可见的颜色的不耐热染料，或能够显示荧光的染料的方法。所述搜索特异性地关注不耐热的染料，以使对光度检测的任何影响最小化，所述光度检测可以是在反应混合物的加工过程中，可以包含染料的情况。
技术实现思路
涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的第一方面是一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的第二方面是根据本公开的含水组合物用于指示所述耐热多肽的存在的用途，所述多肽包含在所述组合物中。涉及如本文公开的所有其他方面和实施方式的第三方面是在将多个组分组合以形成混合物的过程中，检验第一组分的存在并且任选地检验另外的组分的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供作为分离的水溶液的所述混合物的两种或更多的组分，其中所述组分之一包含纯化的具有生物活性的耐热多肽；(b)选择第一组分，并使用第一纯化的不耐热的水溶性物质将所述第一组分染色，在容许温度下处于功能构象的所述第一物质吸收光和/或显示荧光，其中步骤(a)的所述多肽的最大容许温度高于所述第一物质的最大容许温度；(c)任选地选择另外的组分，并使用另外的纯化的不耐热的水溶性物质将所述另外的组分染色，在容许温度下处于功能构象的所述另外的物质吸收光和/或显示荧光，其中步骤(a)的所述多肽的最大容许温度高于所述另外的物质的最大容许温度；(d)将所述两种或更多组分混合；(e)评估步骤(d)中获得的混合物中的第一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.22 US 62/2712111.一种含水组合物，其包含纯化的具有生物活性的耐热多肽，和纯化的不耐热的水溶性物质，在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收光和/或显示荧光，其中所述多肽的最大容许温度高于所述物质的最大容许温度。2.根据权利要求1的含水组合物，其中在所述多肽的容许温度下，所述多肽具有生物活性，或所述多肽的生物活性被可逆地阻断。3.根据权利要求1和2中任一项的含水组合物，其中高于所述多肽的最大容许温度，所述多肽没有生物活性，并且所述多肽的生物活性被不可逆地阻断。4.根据权利要求1-3中任一项的含水组合物，其中在所述物质的容许温度下，所述物质处于功能构象并且吸收光或显示荧光，前提是所述物质没有暴露于高于所述物质的最大容许温度的温度。5.根据权利要求4的含水组合物，其中高于所述物质的最大容许温度，所述物质的构象不可逆地改变，从而变成功能失常的。6.根据权利要求1-5中任一项的含水组合物，其中，相对于对所述多肽和所述物质二者是容许的第一温度，在高于所述第一温度并且高于所述物质的最大容许温度的第二温度下：(a)所述多肽的50%或更多的生物活性存在或被可逆地阻断，并且(b)75%或更多的所述物质具有功能失常的构象。7.根据权利要求6的含水组合物，其中在所述第二温度下，所述多肽的至少一定量的生物活性存在或被可逆地阻断，所述量选自55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%和95%。8.根据权利要求6和7中任一项的含水组合物，其中在所述第二温度下，至少一定量的所述物质具有功能失常的构象，所述量选自80%、85%、90%、95%和100%。9.根据权利要求6-8中任一项的含水组合物，其中在所述第二温度下，所述组合物中的75%或更高的所述物质的吸收光和/或显示荧光的能力被不可逆地阻断。10.根据权利要求6-9中任一项的含水组合物，其中在所述第二温度下，所述组合物中的至少一定量的所述物质的吸收光和/或显示荧光的能力被不可逆地阻断，所述量选自75%、80%、85%、90%、95%和100%。11.根据权利要求1和10中任一项的含水组合物，其中所述具有生物活性的多肽起源于嗜热生物。12.根据权利要求1-11中任一项的含水组合物，其中所述具有生物活性的多肽是酶。13.根据权利要求12的含水组合物，其中所述组合物进一步包含作为所述酶的底物或所述酶的辅助底物的分子。14.根据权利要求12和13中任一项的含水组合物，其中所述酶是模板依赖性RNA或DNA聚合酶。15.根据权利要求1-14中任一项的含水组合物，其中在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收可见光，具体是在380nm至750nm波长范围内的可见光。16.根据权利要求1-15中任一项的含水组合物，其中在容许温度下处于功能构象的所述物质吸收在500nm至650nm波长范围内的可见光。17.根据权利要求15和16中任一项的含水组合物，其中所述物质包含多肽组分和任选的发色团。18.根据权利要求17的含水组合物，其中所述物质包含细菌视紫红质或其功能衍生物。19.根据权利要求18的含水组合物，其中所述物质包含来自盐沼盐杆菌的细菌视紫红质。20.根据权利要求1-14中任一项的含水组合物，其中在使用具有300nm至650nm范围内的波长的光激发后，在容许温度下处于功能构象的所述物质显示荧光，所述荧光具有在350nm至700nm的范围内的发射波长。21.根据权利要求20的含水组合物，其中所述物质包含多肽组分和任选的发色团。22.根据权利要求20和21中任一项的含水组合物，其中所述物质是荧光蛋白，具体地为选自以下的荧光蛋白：绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白/R-藻红蛋白，和红色荧光蛋白/dsRed。23.根据权利要求1-22中任一项的含水组合物，其中所述组合物包含多种不同的纯化的不耐热的水溶性物质，并且其中所述多肽的最大容许温度高于每一种所述物质的最大容许温度。24.根据权利要求23的含水组合物，其中至少在容许温度下处于功能构象的第一物质吸收光，并且至少在容许温度下处于功能构象的第二物质显示荧光。25.根据权利要求1-24中任一项的含水组合物，其中将所述含水组合物放在一个或多个反应容器中，特别是微孔板形式的多个反应容器中。26.根据权利要求14-25中任一项的含水组合物，所述组合物放在实时PCR仪器中。27.根据权利要求1-26中任一项的含水组合物用于指示所述耐热多肽的存在的用途，所述多肽包含在所述组合物中。28.根据权利要求27的用途，其用于额外地指示所述组合物没有暴露于高于所述不耐热的水溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：D海因德尔，H基尔青格，T迈尔，C内尔森，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH